La resistenza delle piante ai patogeni è un fenomeno complesso, alla cui espressione partecipano numerosi aspetti del metabolismo primario e secondario. Gran parte delle informazioni disponibili riguardo ai meccanismi e ai segnali operanti nella resistenza deriva da specie modello, mentre per molte specie coltivate le informazioni sono ancora molto limitate.
Alcuni gruppi di ricerca nel mondo si stanno occupando di caratterizzare più a fondo il processo infettivo di P. viticola su vite e di definire i determinanti della resistenza, presenti in genotipi selvatici delle Vitaceae. Un'analisi su larga scala delle alterazioni trascrizionali associate al processo infettivo di P. viticola è stata recentemente svolta dal nostro gruppo di ricerca, mediante microarray analizzando i tempi più precoci dell'interazione (12 e 24 ore) sia in V. vinifera, suscettibile, che in V. riparia, resistente. I risultati hanno evidenziato in particolare un'intensa e veloce attivazione di geni codificanti proteine di patogenesi della famiglia delle PR-10.
Le PR-10 sono relativamente abbondanti nelle piante, in cui sembrano svolgere diversi ruoli. Possono avere attività ribonucleasica e antimicrobica, sembrano rivestire ruoli nel metabolismo secondario e nella risposta allo stress, possono fungere da serbatoi di citochinine nella cellula. Accumuli di PR-10 o del relativo trascritto sono stati osservati in risposta a patogeni diversi. Poiché la famiglia annovera, in alcune specie, noti componenti allergenici del polline, la caratterizzazione della loro presenza e del loro ruolo nelle specie coltivate riveste una notevole importanza. Non è noto attualmente se e in che misura la resistenza a P. viticola possa dipendere almeno in parte dall'attività di queste proteine.
L'attribuzione di un effettivo ruolo biologico ad una proteina attraverso analisi genetiche funzionali, è al momento di non facile realizzazione in vite, a causa delle difficoltà nella trasformazione genetica. Per superare queste limitazioni esiste la possibilità di intraprendere con altre metodiche esperimenti di "loss-of-function", ad esempio mediante attivazione diretta di un silenziamento genico post-trascrizionale, mediato dalla somministrazione esogena di piccoli RNA prodotti in vitro. La tecnica, fin'ora impiegata solo su cellule animali, è stata applicata su vite nel nostro laboratorio con risultati incoraggianti nel silenziamento di geni marcatori.
Il progetto proposto è finalizzato alla caratterizzazione delle proteine di patogenesi PR-10 in vite ed alla definizione del loro eventuale ruolo nella resistenza nei confronti di P. viticola.
Si articola in tre scopi principali:
a) analisi dell'espressione genica di tutti i membri della famiglia delle PR-10 di vite, in risposta a P. viticola: mediante analisi bioinformatica si cercherà di identificare tutte le sequenze di vite appartenenti alla famiglia delle proteine di patogenesi PR-10 e, attraverso primers specifici, saranno svolte analisi di espressione genica di ciascun membro mediante Real-time RT-PCR, su campioni di vite resistenti e suscettibili sottoposti ad infezione con P. viticola.
b) Espressione in vitro e caratterizzazione dell' attività di una PR-10 di vite:
la proteina PR-10.1, che da analisi trascrizionali appare fortemente indotta in genotipi resistenti in risposta alle infezioni con P. viticola, verrà espressa in vitro in E. coli e purificata per caratterizzarne l'attività in vitro e in vivo.
c) Caratterizzazione dell'attività della proteina PR-10:
la proteina purificata sarà impiegata per: a) valutarne l'attività ribonucleasica in vitro, b) valutarne l'attività antiperonosporica in vivo c) produrre anticorpi policlonali, che saranno impiegati dall'Unità Operativa MILANO, per analisi di localizzazione istologica e citologica nel corso delle infezioni di P. viticola.
d)Analisi funzionale di PR-10 in vite mediante silenziamento genico post-trascrizionale:
Per approfondire l'analisi della funzione delle PR-10 nella risposta a P. viticola, saranno svolti esperimenti di attivazione di silenziamento genico post-trascrizionale, tramite somministrazione esogena di RNA a doppio filamento corrispondenti a porzioni di sequenza conservate tra le PR-10 individuate in vite e anche tramite trasformazione via Agrobacterium rhizogenes con costrutti esprimenti hpRNA. Nell'ipotesi che le PR-10 abbiano un ruolo rilevante nella resistenza a P. viticola, ci si attende che il silenziamento dell'espressione dell'intera famiglia genica nel genotipo resistente provochi un aumento di suscettibilità, fornendo una dimostrazione diretta del ruolo biologico nella interazione esaminata.
