Meccanismi fisiologici e molecolari sottesi all'acquisizione di ammonio e nitrato in radici di mais

Starting date
October 1, 2011
Duration (months)
24
Departments
Biotechnology
Managers or local contacts
Varanini Zeno

Tra i diversi elementi in grado di influenzare l’efficienza d’uso dell’azoto nelle piante l’acquisizione di nitrato e ammonio alla rizosfera e i processi di trasporto nella radice e successiva redistribuzione del nutriente nella pianta costituiscono senza dubbio due aspetti chiave. Questi processi sono scarsamente indagati per quanto riguarda piante coltivate di grande interesse economico quale il mais e soprattutto considerando i meccanismi che coinvolgono l’ammonio come fonte azotata. Con questi presupposti, attraverso lo sviluppo del progetto, si intende analizzare con un approccio fisiologico e molecolare il processo della nutrizione azotata in mais con particolare riferimento alla forma ammoniacale e ai fenomeni trasporto. Sarà utilizzata una linea pura di mais (T 250) che verrà allevata, secondo protocolli comuni a tutte le unità di ricerca del progetto, sia in soluzione idroponica che su suolo, in rizobox, assoggettandola a variazione della concentrazione del nutriente allo scopo di simulare le condizioni di crescita in campo alterando la risposta fisiologica della pianta.
I punti che saranno analizzati riguardano:
i) Composizione quali-quantitativa e dinamica di rilascio degli essudati radicali.
Verranno allevate in soluzione idroponica piante di mais nelle quali, dopo deprivazione di fonti azotate (15 giorni, periodo sufficiente a esaurire le riserve azotate) saranno aggiunte concentrazioni variabili di ammonio, nitrato o nitrato d’ammonio allo scopo modulare la velocità di assorbimento dei nutrienti. Gli essudati radicali saranno e analizzati attraverso HPLC-ESI-MS/MS sia in modalità positiva che in modalità negativa. Con analogo approccio saranno analizzati gli essudati raccolti da piante cresciute in rizobox su un suolo a basso contenuto di azoto totale. In questo caso la crescita delle piante si protrarrà per tre settimane e contestualmente ai trattamenti con le fonti azotate gli essudati saranno raccolti ai tempi opportuni mediante la tecnica di campionamento che prevede l’utilizzo di dischetti di carta da filtro e successiva eluizione in acqua o solventi organici seguita da analisi (HPLC-ESI-MS/MS).
ii) Regolazione dei flussi di N-NH4+ nelle e dalle radici
Verranno utilizzate plantule di mais allevate in soluzione idroponica simulando le modificazioni di disponibilità nutrizionale che si verificano in campo in seguito alle fluttuazioni che subisce il nutriente per cause naturali (es. lisciviazione, nitrificazione e denitrificazione) o antropiche (es. concimazioni). Dopo un certo periodo di allevamento in soluzione nutritiva senza azoto la concentrazione del nutriente verrà variata. Gli influssi verranno misurati con l’uso di 15NO3- o 15NH4+ (soluzioni arricchite al 99%, rivelazione mediante analizzatore elementare CHN accoppiato ad uno spettrometro di massa a discriminazione isotopica 15N/14N) a quei tempi di trattamento in grado di determinare le maggiori variazioni di velocità (induzione/deinduzione per il nitrato repressione/derepressione per l’ammonio). Saranno condotti esperimenti utilizzando anche rizobox: le piante allevate, in un suolo a basso contenuto di N, verranno trattate come descritto sopra e prelevate per determinare i flussi di ammonio e nitrato allo scopo di confrontarli con quelli ottenuti dagli esperimenti in soluzione idroponica.
iii) Coinvolgimento delle entità molecolari responsabili dei flussi dei nutrienti azotati
Utilizzando le informazioni disponibili nella banca dati del genoma di mais, verranno identificati i membri putativi delle famiglie geniche dei trasportatori ad alta affinità per l’ammonio e per il nitrato (AMT1 e NRT2) e della glutammina sintetasi (GS). Le informazioni ottenute dalle analisi bioinformatiche saranno utilizzate per clonare i geni sopra menzionati e per analizzare la loro espressione nei tessuti radicali nelle diverse condizioni sperimentali. L’allineamento multiplo delle sequenze delle famiglie geniche AMT1 e NRT2 ottenute consentirà inoltre di individuare zone nucleotidiche conservate nell’ambito dei geni appartenenti ad una stessa famiglia. Tali regioni saranno utilizzate per esperimenti di silenziamento genico. Il silenziamento post-trascrizionale delle famiglie geniche codificanti trasportatori ad alta affinità di nitrato e ammonio renderà possibile lo studio del ruolo esplicato dai trasportatori a bassa affinità nella regolazione dei flussi di azoto, sia nitrico che ammoniacale, a livello della radice. In particolare il fenotipo delle linee transgeniche ottenute verrà caratterizzato attraverso la determinazione dei flussi nitrato ed ammonio marcati con l’isotopo stabile 15N.

Sponsors:

Ministero dell'Istruzione dell'Università e della Ricerca
Funds: assigned and managed by an external body
Syllabus: FINANZMIUR - Finanziamento MIUR per la ricerca

Project participants

Zeno Varanini
Full Professor
Anita Zamboni
Temporary Assistant Professor
Research areas involved in the project
Plant Sciences - Plant Sciences

Activities

Research facilities