Caratterizzazione delle componenti molecolari delle farine di frumento e degli alimenti derivati dotate di attività biologica in vitro ed in vivo

Starting date
November 15, 2004
Duration (months)
24
Departments
Biotechnology
Managers or local contacts
Dal Belin Peruffo Angelo
Keyword
'FRUMENTO' 'PROLAMINE' 'LECTINE' 'QUALITÀ NUTRIZONALE' 'ATTIVITÀ BIOLOGICA'

Ci si propone di approfondire lo studio sulle modificazioni biochimiche e chimico-fisiche delle proteine delle farine del frumento a seguito dei processi di trasformazione delle stesse in prodotti edibili e della loro digestione, in relazione alla loro potenziale tossicità verso cellule degli epiteli gastrointestinali. Da un punto di vista operativo il progetto verrà articolato in due sessioni svolte in stretta collaborazione con l'U.O. di Padova. In un primo tempo si ipotizza di ottenere in tempi brevi, grazie alle esperienze maturate nell'ambito di progetti di ricerca precedenti, un frazionamento della componente proteica della mollica e della crosta di pane (due materiali con storia termica diversa: la mollica, infatti, subisce un trattamento termico che non supera i 100°C, mentre la crosta raggiunge, durante la cottura, temperature intorno ai 200°C). Il frazionamento sarà realizzato tramite tecniche di solubilità differenziale, anche avvalendosi di sistemi fisici di solubilizzazione (sonicazione) (30). Le frazioni ottenute (proteine solubili ed insolubili) saranno ulteriormente frazionate per cromatografia in condizioni non denaturanti. Le proteine presenti nelle diverse frazioni verranno quindi identificate e caratterizzate tramite metodiche cromatografiche, elettroforetiche e di immunoblotting con anticorpi specifici, alcuni dei quali verranno realizzati appositamente, per singole proteine o gruppi di proteine omologhe (31). In alcuni casi, è ipotizzabile che per la determinazione dell'origine di alcune frazioni proteiche del prodotto cotto sarà necessario ricorrere ad analisi dei profili e delle sequenze aminoacidiche.
Le stesse frazioni saranno caratterizzate per il loro contenuto in zuccheri legati valutando non solo l'entità ma anche il profilo di glicosilazione tramite l'impiego di specifiche lectine vegetali che saranno purificate allo scopo tramite metodiche che sono già acquisite presso il nostro laboratorio (32).
Le singole frazioni purificate verranno fornite all'U.O. di Padova per le prove di simulazione della digestione enterica che saranno state, nel frattempo, messe a punto utilizzando il prodotto cotto non frazionato. Parallelamente il frazionamento verrà condotto per confronto sulla farina cruda, in questo modo si potrà valutare l’effetto del trattamento termico sulle caratteristiche chimico-fisiche e più specificatamente sulla digeribilità delle proteine del frumento.
Lo stesso tipo di analisi verrà, successivamente, effettuato anche su sistemi modello costituiti, o meglio ricostituiti, utilizzando le diverse frazioni della farina (gruppi diversi di proteine associate differenti quantità di amido) miscelate in proporzioni diverse e trattati diversamente (diverse temperature per tempi diversi, in presenza di diversi livelli di umidità), in modo tale da caratterizzare quali-quantitativamente i fattori e le variabili di processo che hanno un effetto sulle modificazioni a carico delle componenti proteiche.
In una seconda fase si inizierà l'esecuzione di analisi dell'attività biologica che verrà verificata, sfruttando le metodiche messe a punto presso questa U.O. nell'ambito di un precedente progetto di ricerca. In particolare si procederà alla purificazione e caratterizzazione delle molecole ad attività lectinica che, come indicato nella sezione precedente, sono state descritte originarsi dalle proteine del frumento durante la digestione. Nel dettaglio verranno applicate: per la purificazione tecniche cromatografiche di affinità basate sull'immobilizzazione di glicoproteine (32) e per la quantificazione tecniche ELISA, anche grazie agli anticorpi che saranno prodotti allo scopo (33, 34). Infine verrà quantificata l'attività biologica/lectinica sia nelle frazioni della farina che del prodotto cotto sempre con tecniche di tipo ELISA che sfruttano l'affinità delle lectine per specifiche glicoproteine immobilizzate ed il loro successivo riconoscimento con anticorpi specifici. Sempre durante precedenti ricerche, il nostro laboratorio ha sviluppato competenze in tutte queste tecniche.
Le analisi descritte verranno applicate alle diverse componenti della farina e del prodotto cotto e successivamente saranno estese ai prodotti di digestione che verranno, mano a mano, forniti dall'U.O. di Padova. In questo modo si ipotizza di identificare parametri e variabili di processo in grado di modificare, come recentemente descritto nel caso della lievitazione con paste acide, l'attività biologica del prodotto finito e quindi la sua potenziale tossicità.
Sulle diverse frazioni e su loro ricombinazioni verranno quindi eseguite prove di citotossicità in vitro i cui risultati andranno ad integrarsi con quelli ottenuti sulla attività biologica identificata presso la nostra U.O. e quella di Padova.
In questo modo si ipotizza di poter definire l'esatta natura delle componenti dotate di attività biologica che si originano con la digestione dei prodotti alimentari derivati dai cereali e di identificare dei parametri dei processi di trasformazione in grado di influenzarne la concentrazione nei prodotti finiti.

Sponsors:

PRIN VALUTATO POSITIVAMENTE
Funds: assigned and managed by the department
Syllabus: PRIN

Project participants

Angelo Dal Belin Peruffo
Corrado Rizzi
Assistant Professor
Gianluca Veneri
Technical-administrative staff

Activities

Research facilities