Analisi della funzione dei geni di interesse agrario

Starting date
January 1, 2005
Duration (months)
12
Departments
Biotechnology
Managers or local contacts
Pezzotti Mario

Uno dei modi per comprendere il ruolo biologico di un gene è quello di confrontare il fenotipo di individui normali con quello di mutanti nei quali l’espressione del gene in esame è annullata o fortemente ridotta. Accanto alle tecniche dell’RNA antisenso, dell’RNAi e della cosoppressione, ampiamente utilizzate per ottenere silenziamento genico in pianta, un ulteriore metodo disponibile è quello della mutagenesi traspositiva. La mutagenesi traspositiva sfrutta la proprietà di elementi genetici mobili, i trasposoni, di spostarsi da un punto all’altro del genoma, determinando la perdita di funzionalità dei geni all’interno dei quali si inseriscono. La linea W138 di Petunia hybrida è caratterizzata dalla presenza di un elevato numero di copie dell’elemento trasponibile endogeno dTph1, la cui sequenza è conosciuta (Gerats et al., 1990), e rappresenta perciò un valido modello per l’ottenimento e lo studio di mutanti inserzionali (Koes et al., 1995; Vandenbussche et al., 2003).
Le possibili conseguenze dell’inserzione di un elemento genetico mobile in un cromosoma dipendono dalle caratteristiche dell’elemento stesso e gli effetti variano dalla totale repressione o, più raramente, dall’attivazione dei geni coinvolti. La trasposizione di queste sequenze note nei geni delle piante causa generalmente delle mutazioni. La rottura per inserzione di una porzione genomica codificante produce quasi sempre delle mutazioni che disattivano completamente il gene. La trasposizione all’interno di regioni regolative può modificare l’espressione genica sia a livello quantitativo che a livello spazio/temporale, causando fenomeni di espressione ectopica. Il trasposone, infatti, può distruggere un sito di riconoscimento per un fattore di trascrizione oppure può alterare la consequenzialità dei moduli trascrizionali impedendo l’assemblaggio del complesso di inizio trascrizione o alterandone la regolazione. L’espressione genica risulta meno alterata se l’inserzione si verifica in porzioni introniche, dal momento che l’elemento trasponibile può essere rimosso con questa sequenza non codificante durante il processamento del trascritto primario.
Le inserzioni nelle cellule della linea germinale vengono trasmesse alla progenie e in presenza di trasposasi risultano instabili. Mutazioni stabili sono prodotte da un’eventuale excisione del trasposone, che lascia nel genoma un’impronta dell’evento di inserzione (“footprint”), rappresentata da una duplicazione del sito di inserzione stesso. L’entità dell’alterazione ottenuta dipende, anche in questo caso, dalla regione interessata dalla mutazione. Mutazioni di regioni differenti degli esoni avranno influenza diversa sulla funzionalità del prodotto genico, ad esempio per un enzima l’attività catalitica sarà fortemente compromessa se le mutazioni si verificano nelle zone che codificano i residui catalitici. Nel caso in cui si verifichi l’excisione precisa, senza lasciare “footprint”, il gene recupera la sua originale funzionalità (reversione).

Presso il Dipartimento Scientifico e Tecnologico dell’Università di Verona sono state allestite due librerie semipermanenti a partire da due popolazioni di petunia rispettivamente di 512 e 4096 piante; tali librerie sono costituite dal DNA e dai semi ottenuti da ogni pianta per autofecondazione e possono essere utilizzate per diversi anni per individuare mutanti per l’inserzione di dTph1 nei geni di volta in volta presi in considerazione. Lo “screening” di una libreria viene condotto mediante una reazione di PCR con un “primer” disegnato sul gene e uno sul trasposone. I prodotti di reazione, separati su gel di agarosio, vengono trasferiti su membrana e ibridati con una sonda marcata costituita da una porzione o dall’intero gene in esame (Koes et al., 1995).
Un ulteriore sviluppo di questo approccio di studio, recentemente messo a punto da Vandenbussche et al., (2004), prevede la marcatura radioattiva del “primer” gene-specifico, la separazione dei prodotti di amplificazione su gel di poliacrilammide e l’isolamento e il sequenziamento diretto dei frammenti di interesse. L’obiettivo di questa ricerca è quello di studiare la funzione dei geni nelle piante agrarie utilizzando i sistemi descritti.

BIBLIOGRAFIA.

Gerats A.G.M., Huits H., Vrijlandt E., Marana C., Souer E., Beld M.: Molecular characterization of nonautonomous transposable element (dTph1) of petunia. (1990) Plant Cell 2: 1121-1128.

Koes R., Sour E., van Houwelinger A., Mur L., Spelt C., Quattrocchio F., Wing J., Oppendijk B., Ahmed S.A., Maes T. (1995)“ Targeted gene inactivation in petunia by PCR based selection of trasposon insertion mutants” Proc Natl Acad Sci USA 92: 8149-8153.

Vandenbussche M, Gerats T. (2004) “TE-based mutagenesis systems in plants: a gene family approach.” Methods Mol Biol. 260:115-27.

Vandenbussche M, Zethof J, Souer E, Koes R, Tornielli GB, Pezzotti M, Ferrario S, Angenent GC, Gerats T. (2003) “Toward the analysis of the petunia MADS box gene family by reverse and forward transposon insertion mutagenesis approaches: B, C, and D floral organ identity functions require SEPALLATA-like MADS box genes in petunia.” Plant Cell Nov;15(11):2680-93.


Sponsors:

Ateneo
Funds: assigned and managed by the department
Syllabus: RICATENEO - Finanziamenti d'Ateneo per la Ricerca Scientifica

Project participants

Linda Avesani
Temporary Assistant Professor
Mario Pezzotti
Full Professor
Sara Zenoni
Associate Professor

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