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Authors:

Vallone, Rosario

Title:

Calcium sensors in plants: biochemical and biophysical study of Arabidopsis thaliana calmodulin-like proteins 14 and 36

Year:

2016

Type of item:

Doctoral Thesis

Tipologia ANVUR:

Altro

Language:

Inglese

Keyword:

EF-hand; calmodulin-like protein; Arabidopsis thaliana; calcium binding; conformational change; protein stability

Abstract (italian):

Nelle piante Il calcio (Ca2+) regola una vasta gamma di risposte fisiologiche agli stimoli esterni. Oltre alla Calmodulina (CaM), altamente conservata, le piante possiedono una famiglia di 50 proteine calmodulin-like (CMLs), presente soltanto in esse, che gioca un ruolo importante nello sviluppo e nella risposta agli stress. Tuttavia, ad oggi, sono state determinate sperimentalmente le proprietà di poche CMLs. Il presente studio riporta una dettagliata caratterizzazione biochimica e biofisica in vitro di due proteine calmodulin-like ricombinanti, CML14 e CML36 di Arabidopsis thaliana, con lo scopo di chiarire se queste proteine abbiano le caratteristiche tipiche dei Ca2+ sensori. La proteina CML14 possiede tre motivi EF-hands di cui uno solo è predetto essere un sito di legame funzionale per il Ca2+, mentre nonostante la presenza di quattro motivi EF-hands, soltanto 3 di essi sono predetti essere funzionali nelle proteina CML36. Per analizzare la forza di legame del Ca2+ e del magnesio (Mg2+) alle proteine CML14 e CML36 abbiamo sfruttato la calorimetria di titolazione isotermica (ITC). Per valutare gli effetti del legame dei metalli sulla struttura e sui cambiamenti conformazionali delle due proteine abbiamo sfruttato la spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR), il dicroismo circolare (CD), la cromatografia di esclusione molecolare (SEC) e la fluorescenza sia intrinseca che basata su un fluoroforo estrinseco (ANS). Inoltre, per studiare la stabilità termica e locale di entrambe le proteine abbiamo sfruttato la calorimetria differenziale a scansione (DSC) e la proteolisi limitata. I nostri risultati hanno dimostrato che la proteina CML14 lega un solo ione Ca2+ con una affinità dell’ordine di micromolare (Kd ~ 12 µM), mentre la presenza del Mg2+ diminuisce l’affinità della proteina per il Ca2+ di circa 5 volte. Sebbene il legame del Ca2+ alla proteina aumenta la stabilità termica e locale, esso non induce né l’aumento dell’idrofobicità a livello della superficie della proteina né un grande riarrangiamento conformazionale. Tuttavia, Il legame del Ca2+ causa cambiamenti strutturali localizzati nell’unico EF-hand funzionale. Per quanto riguarda la proteina CML36, i nostri dati hanno rivelato che il Mg2+ e il Ca2+ inducono cambiamenti conformazionali della proteina significativi e differenti. In particolare, il legame del Ca2+ alla proteina aumenta la stabilità locale e in linea con una funzione di Ca2+ sensore, la proteina va incontro ad un aumento dell’idrofobicità di superficie in maniera dipendente dal Ca2+ ma non dal Mg2+. Inoltre, i nostri risultati ci hanno permesso di speculare che la proteina CML36 nella forma apo- è nello stato flessibile di molten globule. La proteina CML36 lega tre ioni Ca2+ in assenza di Mg2+ con un sito di legame ad alta affinità (Kd ̴ 0.7 µM) e due siti a bassa affinità (Kd ̴ 47 µM), e due ioni Ca2+ in presenza di Mg2+ (Kd1 ̴ 0,7 µM e Kd2 ̴ 5 µM). Questi dati suggeriscono che, in condizioni fisiologiche, Il Mg2+ è legato in maniera costitutiva ad un EF-hand mentre il Ca2+ si associa funzionalmente soltanto a due EF-hands. Considerati nell’insieme, i nostri risultati suggeriscono che la proteina CML14 non sembra avere le caratteristiche di un Ca2+ sensore classico e, in contrasto con una funzione controllata dall’esposizione delle regioni idrofobiche sulla superficie della proteina, indicano un ruolo diverso del Ca2+ nell’interazione di essa con un possibile target. Contrariamente la proteina CML36 mostra le caratteristiche tipiche di un Ca2+ sensore. In conclusione il nostro lavoro fornisce informazioni nuove ed interessanti sulle proprietà biochimiche delle proteine CML14 e CML36 di Arabidopsis che possono essere utilizzate per studi futuri allo scopo di chiarire il loro ruolo fisiologico preciso.

Product ID:

92011

Handle IRIS:

11562/943137

Last Modified:

October 25, 2022

Bibliographic citation:

Vallone, Rosario, Calcium sensors in plants: biochemical and biophysical study of Arabidopsis thaliana calmodulin-like proteins 14 and 36

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