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Authors:

Pedo', Massimo

Title:

Liver bile acid intracellular transporter: NMR studies of unfolding, cooperative binding and interaction with membrane mimetic.

Year:

2010

Type of item:

Doctoral Thesis

Tipologia ANVUR:

Altro

Language:

Inglese

Keyword:

risonanza magnetica nucleare; epressione e purificazione di proteine ricombinanti; mutagenesi sito specifica; liposomi

Abstract (italian):

Gli acidi biliari sono molecole derivanti dal colesterolo le quali, assieme con fosfolipidi, colesterolo e bilirubina rappresentano i principali costituenti della bile. Gli acidi biliari sono molecole detergenti le quali, nel tratto intestinale, favoriscono l’emulsione dei grassi migliorandone così l’assorbimento da parte dell’epitelio intestinale. Recentemente è stato scoperta un’altra importante funzione degli acidi biliari legata al loro ruolo in molti processi di signalling. Alcuni recettori degli acidi biliari sono stati identificati e sono stati riportati diversi disordini metabolici legati a difetti negli eventi di segnalazione dipendente da acidi biliari. Gli acidi biliari sottostanno, nel corpo, ad un processo di ricircolo tra l’intestino ed il fegato chiamato “circolazione enteroepatica” il quale garantisce il recupero ed il successivo riutilizzo di queste molecole. Il trasporto degli acidi biliari è realizzato, negli enterociti e negli epatociti, principalmente attraverso un meccanismo mediato da proteine trasportatrici e coinvolge trasportatori trans-membrana e intracellulari. In questo studio è stato caratterizzato, attraverso spettroscopia NMR, il trasportatore intracellulare di acidi biliari di fegato di pollo (cL-BABP). cL-BABP è una proteina solubile di circa 14 KDa la cui struttura tridimensionale è costituita da un barile beta con 10 filamenti e un motivo helix-turn-helix che copre la regione aperta del barile. Nella prima parte del progetto è stata studiata la stabilità ed il meccanismo di unfolding di cL-BABP. La stabilità strutturale è stata analizzata attraverso esperimenti di scambio idrogeno/deuterio (XH) ed è stato stimato il ΔGop. Il meccanismo di unfolding è stato studiato in maniera residuo specifica attraverso esperimenti NMR di titolazione con urea e i risultati sono stati confrontati con i dati disponibili per altri membri della stessa famiglia proteica. Nella seconda parte del progetto è stato prodotto e analizzato un mutante di cL-BABP (H98Q) in cui l’istidina in posizione 98 è stata sostituita con un residuo di glutammina allo scopo di studiare il ruolo di tale residuo nell’avviare il meccanismo di legame allosterico. La struttura globale della proteina è risultata sostanzialmente inalterata dalla mutazione, nonostante la stabilità risulti leggermente ridotta. L’analisi delle variazioni dei chemical shift tra la proteina WT ed il mutante ha rivelato la presenza di effetti a lunga distanza nel segmento 55-59 il quale risulta in contatto con un ligando. L’analisi della capacità di legame, studiato attraverso NMR e spettrometria di massa (MS), ha indicato una rottura del meccanismo di legame cooperativo evidente come una riduzione dell’affinità di legame per un ligando. La perdita di affinità per un ligando è stata confermata anche attraverso il confronto del coefficiente di diffusione (D) per i ligandi tra WT e H98Q. Nel corso del progetto è stata inoltre studiata la mobilità attraverso la misura NMR dei parametri di rilassamento T1 e T2. L’effetto principale della sostituzione è stato lo smorzamento dei moti lenti osservati nella regione C-terminale nella proteina WT. L’ultima parte del progetto è stata focalizzata sulla caratterizzazione, via NMR, dell’interazione di cL-BABP con vescicole anioniche in presenza del ligando fisiologico, cioè acido glicochenodeossicolico (GCDA). Inizialmente l’associazione con vescicole anioniche, cioè liposomi di 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (DMPG), è stata analizzata in assenza di acidi biliari ed è stata confermata la natura elettrostatica dell’interazione. Successivamente è stato studiato il complesso ternario cL-BABP/DMPG/GCDA. L’analisi di diversi esperimenti NMR di titolazione ha indicato che cL-BABP si associa con liposomi di DMPG nella condizione apo, mentre l’interazione è indebolita nella forma olo. Infatti l’aggiunta del

Product ID:

56950

Handle IRIS:

11562/343893

Deposited On:

June 25, 2010

Last Modified:

November 1, 2022

Bibliographic citation:

Pedo', Massimo, Liver bile acid intracellular transporter: NMR studies of unfolding, cooperative binding and interaction with membrane mimetic.

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