Il ruolo delle proteine Lhc nel ciclo delle xantofille (continuazione, anno 2003)

Data inizio
1 gennaio 2003
Durata (mesi) 
12
Dipartimenti
Biotecnologie
Responsabili (o referenti locali)
Bassi Roberto

La produttività delle piante agrarie è condizionata in misura determinante dalle condizioni ambientali di crescita. Condizioni non ottimali per quanto riguarda fattori abiotici quali, freddo, siccità e temperatura eccessiva sono presenti per periodi più o meno lunghi durante il ciclo vegetativo e possono danneggiare irreversibilmente le colture o diminuirne la produzione. Negli ultimi anni si sono ottenute evidenze sperimentali che il sito del danno primario degli stress abiotici è localizzato nel cloroplasto. I diversi stress abiotici determinano, per vie diverse e talora contrastanti, la produzione di specie reattive dell’ossigeno che danneggiano le proteine cloroplastiche ed in particolare il fotosistema II.

In queste condizioni viene attivato il cosiddetto “ciclo delle xantofille”, il quale consiste nella deepossidazione della violaxantina ad anteraxantina e successivamente zeaxantina. Quest’ultima è attiva sia libera nella membrana, dove contribuisce allo scavenging delle specie reattive dell’ossigeno, sia legata alle proteine Lhc dove induce una modificazione conformazionale che aumenta la capacità di queste proteine di dissipare termicamente l’energia .

Nonostante il ciclo delle xantofille sia noto e studiato da molti anni, ancora molti dei dettagli sono ancora oscuri. Ad esempio non sono noti i dettagli della partecipazione al fenomeno delle proteine Lhc. È infatti noto che queste proteine legano prodotti e reagenti delle reazione, ma non è chiaro il meccanismo. Questo punto è particolarmente interessante se si considera che la regolazione del ciclo delle xantofille dipende sia dall’attivazione dell’enzima, su cui esistono numerosi studi, che dalla disponibilità di substrato e effetto dei prodotti. Diventa particolarmente interessante, quindi, chiarire quale sia il ruolo delle proteine Lhc in questo processo. Altro aspetto interessante a questo riguardo è il chiarimento del diverso ruolo dei diversi componenti di questa famiglia multigenica. Infatti esistono diversi prodotti genici, la cui diversità ha probabilmente un significato importante, visto che è conservata tra molte specie diverse, la singolarità di effetto delle singole proteine, ha ancora molti punti oscuri.

Questo progetto ha lo scopo di chiarire diversi aspetti di questo fenomeno, con approcci diversi:

1) la prima parte del progetto ha lo scopo di identificare i componenti della famiglia Lhc che sono più coinvolti nel ciclo delle xantofille. Questo scopo verrà perseguito sottoponendo le piante a trattamenti che inducono la formazione di zeaxantina e successivamente purificando le varie proteine Lhc e analizzandone il contenuto in xantofille. In questo modo sarà possibile identificare quali prodotti genici legano più zeaxantina in vivo, quando la pianta è sottoposta a stress abiotico. La descrizione del diverso comportamento permetterà di ottenere informazioni utili sui diversi ruoli delle proteine Lhc.

2) La seconda parte del progetto prevede di analizzare il fenomeno attraverso una ricostruzione in vitro del sistema. Infatti, nel nostro laboratorio da diversi anni viene utilizzata un protocollo (ricostituzione in vitro) per la purificazione di proteine Lhc ricombinanti. Proteine ottenute in questo modo verranno incubate con l’enzima chiave del ciclo delle xantofille, la violaxantina de-epossidasi (VDE) anch’essa espressa in E.coli, in condizioni tali da promuovere la reazione di de-epossidazione. Le varie proteine Lhc poi saranno analizzate per vedere l’effetto della reazione sul complemento in pigmenti di questi complessi. La ricostruzione del processo in vitro permetterà di semplificare il campione in esame, permettendo quindi di indagare alcuni aspetti del processo. Ad esempio sarà possibile indagare quali e quanti siti di carotenoidi siano in grado di scambiare xantofille, oppure se la reazione avviene su carotenoidi liberi nella membrana oppure legati alle proteine.
Inoltre, la ricostituzione in vitro delle proteine Lhc permette di modificarne il contenuto in pigmenti. Infatti, modificando opportunamente la miscela dei pigmenti per il refolding, è possibile ottenere dei complessi in cui tutti i siti di legame per i carotenoidi sono occupati da una singola specie. Sfruttando questa possibilità, ricostituendo diverse proteine Lhc con solo violaxantina e incubandole nelle condizioni adatte in presenza della VDE, sarà possibile identificare quali prodotti genici sono in grado di scambiare più efficientemente Violaxantina con Zeaxantina. Questi risultati, confrontati con quelli del punto 1, permetteranno di stabilire se la capacità di queste proteine di scambiare violaxantina con zeaxantina sia una proprietà dipendente solo dalla sequenza primaria oppure se ci siano altri fattori determinanti coinvolti. Di particolare interesse, ad esempio, è stabilire se la posizione delle proteine all’interno del super-complesso dei fotosistemi ha un’influenza o meno sulla capacità di scambio.

3) La terza parte del progetto ha come oggetto di studio la VDE isolata. In particolare lo scopo è di risolverne la struttura molecolare attraverso la diffrazione di cristalli a raggi x. L’ottenimento della struttura di questa proteina è particolarmente interessante se si tiene presente lo scopo generale di comprendere i meccanismi molecolari del ciclo delle xantofille. La struttura della VDE, in particolare, potrebbe essere particolarmente interessante per comprendere la natura dell’interazione tra l’enzima ed il substrato, tra questa proteina solubile e la membrana dei tilacoidi e infine l’eventuale interazione con le proteine Lhc. Questa parte del progetto avverrà in collaborazione con il prof. H. Monaco dell’università di Verona. Questa collaborazione è particolarmente indicata considerando che il prof. Monaco ha risolto la struttura per diffrazione di raggi x di una proteina appartenente alla famiglia delle lipocaline a cui appartiene anche la VDE. Queste proteine hanno la caratteristica di legare substrati idrofobici e questa proprietà influenza le loro proprietà di cristallizzazione. L’esperienza con proteine simili è quindi particolarmente utile.

Enti finanziatori:

Ateneo
Finanziamento: assegnato e gestito dal Dipartimento
Programma: RICATENEO - Finanziamenti d'Ateneo per la Ricerca Scientifica

Partecipanti al progetto

Roberto Bassi
Professore ordinario
Tomas Morosinotto

Attività

Strutture