Studi strutturali sulla Fishelectin di Carpa

Data inizio
1 gennaio 2002
Durata (mesi) 
60
Dipartimenti
Biotecnologie
Responsabili (o referenti locali)
Monaco Ugo Luigi

Nel laboratorio di Biocristallografia, mentre si cercava di isolare la riboflavin binding protein dalle uova di carpa, è stata individuata una proteina che presentava un forte legame con la resina utilizzata per la purificazione: la Sefarosio-riboflavina. Questa proteina ha un peso molecolare di 28.000 e non lega la riboflavina. Esperimenti successivi hanno dimostrato infatti che per legare la proteina non è necessaria la presenza della vitamina e che essa si attacca invece alla matrice di Sefarosio dalla quale può essere eluita con urea 8 M o con 0.4 M N-acetil glucosamina. In collaborazione con il Dipartimento di Biochimica dell'Università di Pavia è stata determinata la sequenza aminoacidica di un peptide di 30 residui, che ci ha consentito di ricercare il gene che lo codifica nelle banche dati con il genoma di varie specie. Sono state così individuate nel genoma dello Zebrafish (Danio rerio) due sequenze di DNA (EST) che si sovrappongono parzialmente tra loro e la cui funzione era sconosciuta. Questi due frammenti, che non contengono alcun codone di stop, codificano una sequenza di 218 aminoacidi che include una sequenza segnale di 20 residui. In questo modo è stata identificata una regione di 198 residui di una proteina la cui catena polipeptidica matura non doveva essere molto più lunga poichè la massa molecolare di questa porzione non si discostava molto da quella da noi determinata sperimentalmente per la proteina isolata. Inoltre la corrispondenza tra quest'ultima e la sequenza nucleotidica individuata in banca dati è stata confermata dalla struttura primaria determinata per alcuni altri peptidi. Successivamente abbiamo completato la determinazione dell'intera strutura primaria della proteina e quindi ricercato in banca dati sequenze omologhe. Sorprendentemente, la proteina da noi scoperta, presenta un'elevata omologia con i membri di una famiglia di lectine che fino ad allora era stata ritenuta specifica del sistema immunitario degli invertebrati e che partecipa al meccanismo dell'immunità innata. La proteina, che abbiamo chiamato Fishelectin (Fish Egg Lectin, FEL), mostra un'elevata omologia oltre che con il gene dello Zebrafish, anche con un gruppo di proteine tra loro omologhe che sono state caratterizzate nell'emolinfa del granchio giapponese (Tachypleus tridentatus) e che sono note come componenti del sistema immunitario innato di questa specie. Poiche' è noto che le proteine dell'horseshoe crab legano i lipopolisaccaridi della membrana esterna dei batteri Gram negativi abbiamo verificato se anche la FEL possieda tale proprietà ed il risultato è stato positivo. Quindi possiamo ritenere di avere identificato un nuovo tipo di lectina in una specie nella quale la presenza di questo genere di molecole non era nota e abbiamo iniziato la sua completa caratterizzazione sia strutturale che funzionale. Tre diverse forme cristalline di questa proteina che sono utilizzabili per la diffrazione di raggi X di cristalli singoli sono state preparate nel nostro laboratorio; due sono ortorombiche e una è trigonale. Sono stati inoltre preparati tre derivati di atomi pesanti della prima delle forme ortorombiche che appartiene al gruppo spaziale P212121 ed ha parametri di cella a=44.47 Å, b=71.83 Å e c=165.30 Å. Lo scopo finale di questa ricerca è la determinazione della struttura tridimensionale della proteina.

Enti finanziatori:

Ministero dell'Istruzione dell'Università e della Ricerca
Finanziamento: assegnato e gestito dal Dipartimento

Partecipanti al progetto

Collaboratori esterni

Maria Elena Carrizo
Cordoba (Argentina) Biochimica Borsista Post Doc

Attività

Strutture