Studio comparativo in vitro dell'evoluzione degli allergeni durante le trasformazioni tecnologiche e i processi digestivi in frumenti convenzionali e transgenici

Starting date
January 3, 2007
Duration (months)
24
Departments
Biotechnology
Managers or local contacts
Dal Belin Peruffo Angelo

Allo scopo di studiare l'evoluzione degli allergeni alimentari durante i trattamenti termici ed i processi digestivi e la loro interazione con l'organismo umano, in questo progetto di ricerca si intende mettere a punto un sistema di digestione "in vitro" che, oltre a simulare la proteolisi, tenga conto anche di altri aspetti collegati alla trasformazione che le proteine alimentari subiscono durante il loro transito nel tratto gastrointestinale (GI). A questo scopo verranno utilizzate farine commerciali di grano duro e tenero (Triticum aestivum cv. Bobwhite e Triticum durum cv. Ofanto e Svevo) in comparazione con linee geneticamente modificate, fornite dalla Unità Operativa di Viterbo (per la descrizione di queste linee si veda il programma di questa U.O.).
In particolare verranno studiati gli effetti dell'emulsione gastrica che si forma nello stomaco, dell'azione dei sali biliari, e dell'ambiente riducente sull'evoluzione che gli allergeni del frumento subiscono durante il processo digestivo. Inoltre, verrà considerato, in un modello cellulare "in vitro" di epitelio, anche il trasporto delle strutture antigeniche attraverso la barriera intestinale. Infine, verrà esaminato il ruolo della transglutaminasi tissutale (tTG), un enzima associato all'epitelio intestinale che può promuovere l'aggregazione di peptidi digeriti in complessi a più alto peso molecolare che, in un precedente lavoro, hanno dimostrato una aumentata immunogenicità (Palosuo et al., 2003).
In collaborazione con l'Azienda Ospedaliera di Padova, verranno identificati e selezionati un certo numero di pazienti con manifestazioni allergiche in seguito all'ingestione di alimenti a base di frumento. La selezione avverrà sulla base della storia clinica, dei risultati ottenuti con i test diagnostici di routine (prick test e RAST) e, qualora il paziente lo consenta, tramite prove di scatenamento eseguite presso le strutture sanitarie. A questi pazienti, dopo consenso informato, verrà prelevata una certa quantità di siero che verrà utilizzato per gli esperimenti sotto riportati.
I prodotti ottenuti in seguito alle diverse reazioni che simulano la trasformazione delle proteine alimentari saranno di volta in volta analizzati sia in saggi di immunorivelazione quali-quantitativi (IgE-immunoblotting and dot-blotting/ELISA) sia in modelli cellulari che possano consentire una valutazione più realistica dell'allergenicità. In questo senso si sfrutterà la possibilità di quantificare il rilascio di istamina, evento scatenante della risposta allergica, da parte di linee cellulari leucemiche umane (quali per esempio, le KU812) capaci di differenziare, dopo stimolazione interleuchinica, in basofili maturi dotati del recettore ad alta affinità per le IgE (FceRI) (Shim. et al., 2002). Le cellule così differenziate saranno quindi incubate con il siero di persone allergiche al frumento permettendo la fissazione delle IgE presenti in tali sieri sui recettori FceRI. Successivamente, su questo modello cellulare, si cimenteranno i prodotti delle trasformazioni gastrointestinali, quantificando il rilascio di istamina con tecniche fluorimetriche od immunochimiche (Poulsen, 2001). In questo modo si ipotizza di poter identificare specifiche frazioni in grado di determinare una risposta ipersensibile anziché semplicemente evidenziare una specificità di legame delle IgE spesso priva di un preciso significato fisiopatologico.
Per valutare gli effetti delle modalità di preparazione degli alimenti derivati dal frumento ed, in particolare, l'effetto del trattamento termico sul loro comportamento come antigeni nel tratto GI, verranno allestiti campioni ottenuti dall'impasto di farina di frumento e acqua, trattati a tre diverse temperature: temperatura ambiente (campione di controllo), 90°C e 180°C, per simulare le temperature di essiccamento e/o cottura di prodotti derivati dal frumento (per es. pasta e pane). I campioni così ottenuti verranno quindi sottoposti a trattamenti successivi in vitro che mimano le diverse fasi del processo digestivo che avviene in vivo. Dopo un breve trattamento iniziale con amilasi salivare, i campioni verranno inseriti in un sistema che possa rappresentare la emulsione che dovrebbe prodursi nello stomaco durante un pasto reale. Tale emulsione potrà essere ottenuta sonicando i campioni al pH dello stomaco in presenza di trigliceridi. La interazione tra proteine ed emulsione verrà quantificata misurando le proteine non adsorbite su di essa (Burnett et al., 2002).
L'effetto sulla digeribilità gastrica delle proteine adsorbite sull'emulsione verrà quindi valutato (quantificando l'azoto precipitabile con acido tricloroacetico e l'azoto liberato) dopo aver sottoposto il sistema a digestione con pepsina (pH 2) e confrontando i risultati con quelli ottenuti in assenza dell'emulsione. Successivamente, all'emulsione trattata con pepsina, e dopo aver portato il pH a 7,4, verranno aggiunti pancreatina (un preparato contenete gli enzimi pancreatici, compresa la lipasi) e sali biliari (che agiscono come detergenti) per simulare l'ambiente duodenale (Burnett et al., 2002). Il risultato di questi trattamenti, che dovrebbero da una parte modificare le caratteristiche di solubilità delle proteine dei campioni, e, dall'altra, provocarne la degradazione in peptidi, verrà studiato tramite quantificazione dell'azoto solubile ed insolubile, analisi elettroforetiche e cromatografiche (esclusione molecolare) ed, inoltre, attraverso tecniche immunochimiche (immunoblotting ed ELISA) utilizzando sia anticorpi policlonali specificamente diretti contro diverse proteine del frumento (Pasini et al., 2001) sia i sieri dei pazienti allergici. Le frazioni peptidiche della miscela (frazionate per cromatografia ad esclusione molecolare su resine Superdex) verranno anche saggiate per la loro capacità di liberare istamina nel modello cellulare sopra descritto. In questo modo si potrà stabilire, da una parte, se effettivamente la presenza di una emulsione gastrica può modificare la digeribilità delle proteine nello stomaco e, dall'altra, se l'ambiente duodenale, per la presenza di sali biliari, è in grado di provocarne il rilascio e/o la degradazione con conseguenze sulla allergenicità potenziale e reale dell'alimento a base di frumento.
Data la presenza di ponti disolfuro tra le varie subunità prolaminiche che costituiscono la struttura del glutine si può ipotizzare la presenza, nel digerito, di frammenti peptidici ancora legati tra loro tramite questi legami. Tali strutture peptidiche miste potrebbero contenere epitopi multipli in grado di legarsi a più IgE provocando, in questa condizione, la degranulazione cellulare e quindi la liberazione dei mediatori che provocano la risposta allergica. Viceversa, i peptidi allo stato ridotto potrebbero non avere più questo effetto. Appare dunque interessante studiare l'effetto della riduzione dei ponti disolfuro sulla allergenicità dei digeriti delle proteine degli alimenti derivati dal frumento. Tale riduzione potrebbe avvenire spontaneamente nell'intestino, che potrebbe avere un potenziale riducente sufficiente a provocarla. Allo scopo di studiare questo aspetto, i peptidi risultanti dalla sequenza di trattamenti sopra descritti verranno sottoposti a riduzione chimica (per aggiunta di sostanze in grado di abbassare il potenziale red-ox) ed analizzati e frazionati, prima e dopo la riduzione, tramite cromatografia ad esclusione molecolare. I peptidi frazionati nelle due condizioni verranno quindi impiegati in esperimenti mirati a valutarne le variazioni nella capacità di legare le IgE (dot blotting/ELISA). Le frazioni che si dimostreranno in grado di essere riconosciute dalle IgE verranno quindi sottoposte al saggio per la liberazione di istamina nel modello cellulare messo a punto a questo scopo. Quindi, in tutti i diversi passaggi sopra descritti, potrà essere seguita e descritta qualitativamente e quantitativamente l'evoluzione delle componenti potenzialmente allergeniche presenti nell'alimento a base di frumento. Inoltre, l'uso di campioni trattati a temperature diverse prima della digestione nel sistema modello descritto, consentirà di avere indicazioni su quale possa essere l'effetto dei diversi processi di preparazione degli alimenti derivati dal frumento sulla loro degradabilità gastrointestinale in relazione alla permanenza, fino a livello intestinale, di strutture dotate di potenziale allergenico.
Una volta descritta l'evoluzione delle frazioni potenzialmente allergeniche in relazione sia ai trattamenti termici usati nella preparazione dell'alimento, sia al processo digestivo, verranno studiati gli aspetti relativi alla traslocazione dei peptidi generati dalla digestione attraverso l'epitelio intestinale.
Le frazioni (poli)peptidiche derivanti dagli esperimenti descritti che avranno dimostrato la maggiore potenzialità allergenica nel saggio per la liberazione di istamina verranno testate su un modello cellulare, già messo a punto (Dalla Pellegrina et al., 2005) e consistente in una coltura di cellule Caco-2 differenziate al fine di costituire un monostrato polarizzato rappresentativo dello epitelio intestinale. Si utilizzeranno pozzetti transwell contenenti lo strato di cellule modello depositando nella camera superiore le frazioni peptidiche da saggiare (Dalla Pellegrina et al., 2005). Dopo incubazione, si eseguiranno prelievi dalla camera inferiore e si saggerà la capacità del materiale transcitosato di legare le IgE del siero dei pazienti allergici come pure di indurre il rilascio di istamina con il saggio sopra descritto.
Verrà inoltre verificata, sulle cellule Caco-2 del modello di epitelio polarizzato, la inducibilità del recettore per le IgE CD23 (FceRII), trattando le cellule stesse con IL4, che dovrebbe promuovere l'induzione di questo recettore, che, in vivo, è presente sulle membrane apicali degli enterociti (Mayer, 2005). Se l'inducibilità del CD23 nelle cellule del modello fosse dimostrata, si procederà incubando lo strato monocellulare con il siero di pazienti allergici al fine di promuovere l'adesione delle IgE al recettore cellulare.
Successivamente si verificheranno, cimentando il modello di mucosa in vitro così trattato, le eventuali modificazioni della permeabilità nei confronti delle specifiche frazioni allergeniche. Con questi esperimenti si prevede di poter stabilire la possibilità, per i prodotti della digestione di alimenti derivati dal frumento trattati a differenti temperature di cottura e dotati di attività potenzialmente allergenica, di attraversare l'epitelio intestinale.
I (poli)peptidi dimostratisi in grado, negli esperimenti precedenti, di superare lo strato di cellule Caco-2 verranno quindi trattati con tranglutaminasi tissutale (tTG) purificata. Questo enzima, localizzato sotto l'epitelio intestinale, ha una notevole capacità di modificare le prolamine del glutine, provocando tra l'altro il cross-linking dei loro frammenti proteolitici in strutture con aumentata capacità di legare IgE (Palosuo et al., 2003). Gli effetti di questo trattamento verranno studiati tramite cromatografia ad esclusione molecolare, SE-HPLC, analisi elettroforetiche ed immunologiche sia con anticorpi diretti contro le prolamine, sia con i sieri dei pazienti allergici. Le eventuali variazioni nell'entità del legame con le IgE dei pazienti, risultanti dalla azione della tTG, verranno quantificate tramite misure in ELISA. Inoltre queste stesse frazioni verranno saggiate per la capacità di liberare istamina.
Le frazioni (poli)peptidiche, che in base agli esperimenti precedenti, avranno dimostrato di essere i migliori candidati ad agire come allergeni dei prodotti derivati dal frumento, verranno passate alla Unità Operativa di Catania per una caratterizzazione biochimico-molecolare che consentirà, tra lo altro, di identificare le sequenze aminoacidiche maggiormente coinvolte nel determinare le risposte di ipersensibilità IgE mediata alle proteine del frumento.
Tutti gli esperimenti descritti verranno condotti anche con farine di frumento transgenico fornite dalla Unità Operativa di Viterbo. Quindi, sia con metodi immuno-chimici e -enzimatici che con i modelli cellulari sopra descritti si identificheranno e/o quantificheranno i potenziali allergeni tramite la valutazione della capacità delle IgE di legare i peptidi immunoreattivi presenti nelle diverse frazioni derivanti dalle linee di frumento transgenico. In questo modo, comparando i risultati ottenuti dalle linee di frumento transgenico con le varietà genitrici, si potranno avere informazioni riguardo le variazioni del potenziale allergenico eventualmente indotte dalla modificazione genetica.
I protocolli messi a punto verranno inoltre utilizzati per testare la potenziale allergenicità di altre specifiche proteine quali quelle che l'U.O. di Viterbo intende far esprimere in frumento oppure quelle che verranno purificate dall'U.O. di Pisa.

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PRIN VALUTATO POSITIVAMENTE
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Gianluca Veneri
Technical-administrative staff

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