Sviluppo di lattobacilli probiotici ricombinanti per la produzione di proteine e peptidi autoantigenici umani protettivi contro il diabete autoimmune.(continuazione 2004)

Data inizio
1 settembre 2004
Durata (mesi) 
24
Dipartimenti
Biotecnologie
Responsabili (o referenti locali)
Dellaglio Franco

Una serie di ragioni di carattere immunologico ed applicativo rendono lo sviluppo di efficienti vaccini orali ed edibili un’alternativa interessante ai tradizionali vaccini inettabili e tale aspetto ha ricevuto notevoli attenzioni nell’ultimo decennio. Grazie alla facilità di produzione, di manipolazione e di somministrazione tali vaccini rappresentano prodotti a costo ridotto, la cui diffusione è auspicabile soprattutto nei i paesi del terzo mondo. Il principale vantaggio derivante dal rilascio di antigeni vaccinali ai tessuti mucosi gastrointestinali deriva dalla loro capacità di elicitare sia una risposta locale molto intensa, che di indurre una risposta immunitaria generale, riducendo i rischi collegati alla somministrazione per via sistemica (1).
Una intensa attività di sviluppo di “carriers” costituiti da versioni ricombinanti di batteri associati agli alimenti è stata intrapresa negli ultimi dieci anni. La scelta di batteri lattici (LAB) come veicoli per la somministrazione di vaccini è fondata principalmente sul concetto che essi possono essere assunti oralmente in dosi massicce, grazie al loro “status” di “non-patogeno”. L’uso dei LAB permettere di ovviare alla necessità di purificare un antigene prima di somministrarlo. Alcuni generi della famiglia dei batteri lattici, come i lactobacilli e i lactococchi, hanno una lunga storia di uso igienicamente sicuro in prodotti alimentari fermentati e sono ufficialmente annoverati tra i batteri “generally regarded as safe” o GRAS. Alcune specie del genere Lactobacillus sono capaci di colonizzare il tratto GI dell’uomo o degli animali, dove si pensa che essi rivestano un ruolo cruciale nel mantenimento di una microflora che favorisce lo stato di buona salute. I LAB offrono altri vantaggi come sistemi di trasporto di sostanze alle mucose, quali la resistenza in ambienti acidi, che sussiste sia negli alimenti fermentati che durante il transito nel tratto gastrico, il recente progresso nella conoscenza della loro genetica, che facilita la costruzione di ceppi ricombinanti. Diverse specie, come Lactococcus lactis e poche specie del genere Lactobacillus (L. plantarum, L. casei, L. fermentum) sono state prese come modello per lo sviluppo di sistemi di trasporto alle mucose. Negli ultimi dieci anni i sistemi di espressione in tali specie batteriche sono stati ottimizzati, raggiungendo livelli di espressione di antigeni eterologhi fino a 2-10 mg L-1 di coltura. La selezione dei ceppi “carrier” è un passaggio critico; caratteristiche ceppo-specifiche quali il livello di persistenza nell’intestino e l'effetto immunomodulante intrinseco sull’ospite potrebbero avere rilevanza. Una ottimale presentazione dell’immunogeno da parte della cellula batterica può variare anche in dipendenza di altri fattori, quali la localizzazione dell’antigene nella cellula. Sono stati sviluppati sistemi di espressione che permettono di localizzare le proteine eterologhe nel citoplasma, alla superficie della cellula o nel mezzo esterno. Molti costrutti di espressione comprendono segnali endogeni di secrezione ed ancoraggio alla membrana, come ad esempio il gene prtP (codificante per la proteasi P) di Lc. lactis o il sistema M6 di Streptococcus gordonii . Per evitare una instabilità strutturale ed ottenere una espressione permanente di geni eterologhi è stata creata una varietà di vettori di integrazione, che permettono di collocare i geni esogeni nel cromosoma batterico. Ad oggi è stato dimostrato che risposte immunitarie antigene-specifiche, sistemiche o localizzate a livello delle mucose, possono essere elicitate in topi attraverso la via mucosale con l’uso di molti dei sistemi studiati in LAB. Le differenze in termini di immunogenicità sono spesso correlate al livello di espressione dell’antigene, oltre che alla localizzazione dell’antigene nella cellula batterica, alla capacità del “carrier” di sopravvivere al passaggio attraverso lo stomaco e di risiedere temporaneamente nel tratto GI. Il frammento C della tossina del tetano (TTFC) è stato usato e studiato estensivamente negli anni scorsi come antigene modello, ma anche proteine batteriche ed epitopi protettivi virali sono stati espressi in diversi modelli in LAB.
Recentemente ceppi di LAB sono stati manipolati geneticamente per indurre la tolleranza orale, piuttosto che un’immunizzazione attiva in modelli animali. E’ noto da tempo che l’alimentazione con proteine solubili può determinare uno stato di “non-responsività” immunologica, mentre una forma particolata dell’antigene può accentuare la risposta immunitaria. Questo particolare aspetto della mucosa intestinale può essere sfruttata per indurre tolleranza verso gli autoantigeni nelle malattie autoimmuni. Maassen et al., (2) hanno espresso la proteina autoantigenica mielina basica (hMBP) in L. casei/zeae ATCC 393 per indurre la tolleranza orale in modelli animali che sviluppano l'encefalomielite autoimmune. Lactobacilli vivi capaci di esprimere la hMBP hanno attenuato la malattia quando somministrati oralmente. L’effetto massimo è stato osservato nel caso del sistema di espressione intracellulare, probabilmente a causa dell’effetto protettivo della cellula batterica contro la degradazione ed al ruolo immunomodulatorio intrinseco del “carrier” microbico.
Studi su modelli animali di diabete autoimmune spontaneo hanno dimostrato che la somministrazione parenterale o nasale di autoantigeni, quali la glutammato decarbossilasi (GAD65) o peptidi dell’insulina, può prevenire (o ritardare) l'insorgenza della malattia, sembra grazie all'induzione di tolleranza orale. L'induzione di tolleranza richiede solitamente elevate quantità di autoantigene, che nel caso della GAD65 umana, sono difficili da ottenere. Allo scopo di sviluppare strategie per la prevenzione del diabete autoimmune (T1DM) tramite induzione di tolleranza orale verso autoantigeni specifici si sono sviluppati sistemi per l’espressione di antigeni in piante da utilizzare come “nutraceutici”. L'obiettivo di produrre alimenti o ingredienti arricchiti in specifici determinanti antigenici mediante il clonaggio di geni codificanti in batteri lattici associati agli alimenti rappresenta, in questo contesto, una valida alternativa.

Gli scopi specifici della ricerca sono:
-Selezione di ceppi di Lactobacillus plantarum e L. casei da utilizzare per la costruzione di vaccini orali vitali, sulla base di caratteristiche di resistenza al transito gastrointestinale, di adesività epiteliale e di manipolabilità genetica.
-Ideazione delle strategie di espressione e di localizzazione cellulare della proteina autoantigenica GAD65 full-lenght e del peptide B9-23 dell’insulina in lattobacillo e costruzione dei vettori plasmidici per la trasformazione dei ceppi batterici selezionati.
-Valutazione della stabilità e del livello di espressione di proteina e peptide eterologhi (GAD65 e peptite B9-23) in lattobacillo.
-Analisi microbiologica e molecolare della microflora fecale dei topi NOD (diabetici non obesi) nel corso della somministrazione dei lattobacilli ricombinanti, al fine di valutare la vitalità degli stessi nell’intestino e di monitorare l’evoluzione della microflora indotta da tale somministrazione.

L’effetto di immuomodulazione indotto sugli animali sperimentali dalla somministrazione orale dei lattobacilli ricombinanti sarà valutato dal gruppo di Ricerca coordinato dal dott. Alberto Falorni dell’Università di Perugia, con cui esiste già un rapporto di collaborazione scientifica.

Riferimenti bibliografici
1. Wells JM, Mercenier A. (2003). Lactic acid bacteria as mucosal delivery vehicles. In: BJB Wood & PJ Warner (Eds), The genetic of lactic acid bacteria. (pp. 261-290). New York, USA: Kluwer Academic/ Plenum Publishers.
2. Maassen et al., (2003), Vaccine 21: 4685-4693.

Enti finanziatori:

Ateneo
Finanziamento: assegnato e gestito dal Dipartimento
Programma: RICATENEO - Finanziamenti d'Ateneo per la Ricerca Scientifica
Ministero dell'Istruzione dell'Università e della Ricerca
Finanziamento: assegnato e gestito dal Dipartimento
Programma: FINANZMIUR - Finanziamento MIUR per la ricerca

Partecipanti al progetto

Franca Rossi
Tecnico-Amministrativo
Desj Simeoni

Attività

Strutture