Caratterizzazione delle proteine del frumento dotate di attività biologica in vitro.

Data inizio
1 settembre 2005
Durata (mesi) 
12
Dipartimenti
Biotecnologie
Responsabili (o referenti locali)
Dal Belin Peruffo Angelo

Con il presente progetto ci si propone di approfondire lo studio, intrapreso nell'ambito di precedenti progetti di ricerca, sulle modificazioni biochimiche e chimico-fisiche delle proteine delle farine del frumento a seguito dei processi di trasformazione delle stesse in prodotti edibili e della loro digestione, in relazione alla loro potenziale tossicità verso cellule degli epiteli gastrointestinali.
Proteine delle farine dei cereali, identificabili soprattutto nella frazione delle prolamine, possono svolgere un ruolo di primo piano nella induzione di patologie dell’apparato gastroenterico (1,2). Queste ed altre proteine delle farine non ancora identificate potrebbero essere coinvolte anche in altre reazioni avverse ai prodotti edibili derivati dai cereali. Le reazioni avverse agli alimenti possono avere una base immunologica, responsabile ad esempio dell’insorgenza di allergie caratterizzate da un ben identificato quadro immunopatologico, oppure una base non immunologica (3). È stato dimostrato che la tossicità delle proteine del frumento si manifesta a seguito di trasformazioni biochimiche delle stesse quali: proteolisi ad opera di enzimi digestivi, modificazioni enzimatiche ad opera di enzimi espressi dal tessuto epiteliale dell’apparato gastroenterico (5). Nel caso delle intolleranze alimentari, invece, non sono ancora stati completamente chiariti i meccanismi responsabili della tossicità delle proteine e/o di altre componenti molecolari dei cereali.
Una caratteristica comune a tutte le patologie infiammatorie dell'intestino umano sembra essere una alterazione nella produzione di citochine. Alterazioni di questo tipo sembrano essere alla base dei processi di induzione, promozione e mantenimento di queste patologie flogistiche (6). Potrebbe avere una qualche correlazione in tal senso la recente osservazione che alcune lectine vegetali possono stimolare il rilascio di citochine proinfiammatorie da parte di alcune cellule del sistema immune (7). In questo contesto risulta interessante la dimostrazione che: 1. componenti con attività lectinica possono formarsi durante la digestione enzimatica delle proteine del frumento e che queste stesse molecole sarebbero coinvolte nel determinismo delle lesioni proprie del morbo celiaco (8); 2. i trattamenti tecnologici possono influenzare la concentrazione di queste componenti tossiche nel prodotto finito (9).
Con il presente progetto si intende realizzare un protocollo per il frazionamento della componente proteica della mollica e della crosta di pane. Le frazioni ottenute (proteine solubili ed insolubili) saranno ulteriormente frazionate per cromatografia in condizioni non denaturanti. Le proteine presenti nelle diverse frazioni verranno quindi identificate e caratterizzate tramite metodiche cromatografiche, elettroforetiche e di immunoblotting con anticorpi specifici, alcuni dei quali verranno realizzati appositamente, per singole proteine o gruppi di proteine omologhe. Le stesse frazioni saranno caratterizzate per il loro contenuto in zuccheri legati valutando non solo l'entità ma anche il profilo di glicosilazione e/o di glicazione tramite l'impiego di specifiche lectine vegetali che saranno purificate allo scopo tramite metodiche che sono già acquisite presso il nostro laboratorio.
Le singole frazioni purificate verranno sottoposte a prove di simulazione della digestione enterica che saranno state, nel frattempo messe, a punto utilizzando il prodotto cotto non frazionato. Parallelamente il frazionamento verrà condotto per confronto sulla farina tal quale, in questo modo si potrà valutare l’effetto del trattamento termico sulle caratteristiche chimico-fisiche e più specificatamente sulla digeribilità delle proteine del frumento.
Lo stesso tipo di analisi verrà, successivamente, effettuato anche su sistemi modello costituiti, o meglio ricostituiti, utilizzando le diverse frazioni della farina (gruppi diversi di proteine con differenti quantità di amido) miscelate in proporzioni diverse e trattati diversamente (diverse temperature per tempi diversi, in presenza di diversi livelli di umidità), in modo tale da caratterizzare quali-quantitativamente i fattori e le variabili di processo che hanno un effetto sulle modificazioni a carico delle componenti proteiche. Infine si inizierà l'esecuzione di analisi dell'attività biologica che verrà verificata, sfruttando le metodiche messe a punto in precedenti studi.
In particolare si procederà alla purificazione e caratterizzazione delle molecole ad attività lectinica che derivano dalle proteine del frumento durante la digestione. In questo modo ci si auspica di:
1) Realizzare di un protocollo per il frazionamento della componente proteica della mollica e della crosta di pane e loro e la sua caratterizzazione. 2) Valutare dell’effetto del trattamento termico sulle caratteristiche chimico-fisiche e più specificatamente sulla digeribilità delle proteine del frumento. 3) Caratterizzare sotto un profilo quali-quantitativo i fattori e le variabili del processo di panificazione che hanno un effetto sulle modificazioni a carico delle componenti proteiche.
4) Analizzare l'attività biologica e caratterizzare le molecole ad attività lectinica derivate dalle proteine del frumento durante la digestione.
Bibliografia
(1) R.M.Helm et al. Curr. Opinion Immunol. (2000) 12: 647
(2) D.D.Kasarda Cereal Foods Word (2001) 46: 209
(3) C.Ortolani et al. Allergy (1999) 54: 27
(4) M.F.Neurath et al. Clinical Immunology, R.R.Rich ed., Mosby, London (2001) chapter 87
(5) Ø.Molberg et al. Nature Med. (1998) 4: 713
(6) T.O. Kerttula et al. Scand. J. Immunol. (1999) 49, 197
(7) E. Muraille Cellular Immunology (1999) 10, 191
(8) Auricchio et al. Biochem. Bichim. Res. Commun. 21. 428, 1984
(9) R. Di Cagno et al. Applied and Enviromental Microbiology (2004) 70, 1008

Enti finanziatori:

Ateneo
Finanziamento: assegnato e gestito dal Dipartimento
Programma: RICATENEO - Finanziamenti d'Ateneo per la Ricerca Scientifica

Partecipanti al progetto

Gianluca Veneri
Tecnico-Amministrativo

Attività

Strutture