Crescita di sferoidi tumorali: simulazione numerica e validazione sperimentale del modello

Starting date
October 1, 2005
Duration (months)
12
Departments
Biotechnology
Managers or local contacts
Chignola Roberto

Una buona comprensione della cinetica di crescita dei tumori è essenziale per progettare nuove e migliori strategie terapeutiche [Norton 1999]. Inoltre, da un punto di vista clinico e' noto che il problema principale nella gestione di molte neoplasie solide non riguarda masse tumorali di grosse dimensioni, che in genere vengono aggredite mediante trattamento chirurgico, quanto masse di piccola dimensione o comunque con dimensione spaziale al di sotto dei limiti della diagnostica per immagini (circa 1 mm3). Questi piccoli aggregati tumorali possono sfuggire ai trattamenti convenzionali e, nel tempo, determinare recidiva (malattia minima residua) spesso con caratteristiche fenotipiche diverse dal tumore primario (es. acquisita resistenza ai farmaci, acquisita capacita' di crescita in tessuti diversi ovvero capacita' di originare metastasi).
Lo studio di queste micro-masse è estremamente difficile anche in modelli animali giacché non è possibile evidenziarle con tecniche di imaging e quindi aver accesso a misure sperimentali. D'altra parte, le colture cellulari tradizionali vengono effettuate permettendo alle cellule di aderire direttamente o indirettamente a supporti plastici e di formare così un monostrato bidimensionale di cellule. In questo caso viene persa l'informazione originata dalla struttura tridimensionale degli aggregati, una struttura che determina numerose caratteristiche biologiche importanti quali la espressione di determinati geni, una diffusione rallentata di anaboliti e di cataboliti ecc. e in ultima analisi la espressione di nuovi fenotipi quali la resistenza ai trattamenti radioterapici. Una valida alternativa consiste nella realizzazione di colture tridimensionali di cellule tumorali [Sutherland 1988].
Queste colture vengono ottenute impedendo alle cellule tumorali - attraverso diverse strategie sperimentali - di aderire alla superficie plastica delle normali fiasche da coltura cellulare. Le cellule, allora, aderiscono tra loro formando dei piccoli aggregati del diametro di 50-100 micron che possono essere prelevati mediante tecniche di micromanipolazione standard e seminati individualmente in terreno di coltura. Come conseguenza della proliferazione cellulare, questi aggregati aumentano di volume fino a raggiungere dimensioni dell'ordine del mm cubo (che corrisponde approssimativamente ad un contenuto dell'ordine del milione di cellule). Per la loro architettura tridimensionale, gli sferoidi acquisiscono proprieta' biologiche interessanti per altro non osservabili nelle tradizionali colture in monostrato [Sutherland 1988].
Gli sferoidi rappresentano un modello sperimentale intermedio tra le colture cellulari tradizionali e i tumori in vivo e, crescendo in vitro, sono accessibili a diversi tipi di misura. Tuttavia, gli sferoidi hanno un limite importante dato che essi crescono in assenza di un tessuto normale circostante e quindi in assenza di fattori molecolari e meccanici che potenzialmente possono perturbare la crescita dell'aggregato neoplastico. Gli sferoidi forniscono comunque una gran mole di osservazioni che puo' essere utilizzata per ideare e saggiare ipotesi biofisiche sulla crescita dei tumori solidi nella fase prevascolare.
Per superare le difficoltà associate alle ricerche in vivo e le notevoli limitazioni delle ricerche in vitro, molti ricercatori hanno tentato di sviluppare dei modelli matematici o numerici di crescita cellulare e tumorale in particolare. Stiamo sviluppando un modello numerico della crescita dei tumori solidi e stiamo lavorando per renderlo cosi’ avanzato e dettagliato da rappresentare un vero laboratorio virtuale per lo studio in silico di sferoidi tumorali [Chignola&Milotti 2004]. Tuttavia, da un lato le previsioni teoriche effettuate con il simulatore numerico debbono essere validate sperimentalmente e dall’altro la sperimentazione e’ necessaria al fine di ottenere stime ragionevoli dei parametri considerati nel modello.
Le attivita' di ricerca del presente progetto si svilupperanno secondo le linee di seguito elencate e descritte:
1) esecuzione di esperimenti volti alla dimostrazione delle previsioni teoriche sulla sincronizzazione del ciclo cellulare in cellule tumorali;
2) misura sperimentale delle cinetiche di crescita di sferoidi tumorali, della composizione degli stessi in cellule in attiva fase di proliferazione, cellule quiescenti e cellule morte e confronto con le simulazioni numeriche;
Breve descrizione:
1) le cellule tumorali crescono in modo asincrono a causa della diseguale suddivisione di organelli ed enzimi alla mitosi che in ultima analisi determinano la velocita’ con cui una cellula percorre il ciclo cellulare [Chignola&Milotti 2005]. Alcune simulazioni preliminari effettuate con il nostro modello hanno dimostrato che e' possibile in linea teorica sincronizzare, almeno parzialmente, la popolazione di cellule tumorali somministrando ciclicamente alle stesse i nutrienti. Il periodo di somministrazione dovrebbe essere approssimativamente uguale al tempo medio di duplicazione delle cellule. Tale previsione deve essere verificata sperimentalmente. A questo scopo verranno utilizzate cellule tumorali umane di diversa origine istotipica di normale uso nel laboratoro (es. cellule Caco2 di carcinoma del colon, Molt3 di leucemia T, Raji di leucemia B, MCF7 di carcinoma mammario). Verranno preparati terreni nutritivi a diversa composizione biochimica che verranno successivamente somministrati alle cellule in modo periodico secondo le indicazioni ottenute con le simulazioni numeriche. Il contenuto di ATP cellulare verra' misurato su base giornaliera mediante test della luciferina/luciferasi su estratti cellulari e conseguente misura di fotoni emessi utilizzando un luminometro per micropiastre. La distribuzione delle cellule lungo il ciclo
cellulare verra' effettuata mediante saggi citofluorimetrici dopo colorazione del DNA con coloranti fluorescenti (es. etidio bromuro) secondo procedure standardizzate e di largo uso nel laboratorio;
2) nella sua configurazione finale, il simulatore dovra' essere in grado di riprodurre al computer la crescita di sferoidi. Il simulatore che proponiamo e' in grado di descrivere le interazioni microscopiche tra le cellule e tra le cellule e il loro microambiente, quest'ultimo essendo ben caratterizzato sotto il profilo biochimico (es. diffusione di nutrienti ed ossigeno). Ci si attende, dunque, che il simulatore catturi l'informazione del processo di crescita mancante in altri modelli di proliferazione tumorale. Parametri quali la dimensione del cuore necrotico in funzione del raggio dello sferoide, la distribuzione delle cellule proliferanti nella massa tumorale, la perdita di cellule mitotiche dalla superficie e la loro riassociazione sulla superficie dello sferoide, il movimento relativo delle cellule all'interno dello sferoide, la formazione di gradienti di molecole nutritive sono direttamente osservabili e misurabili in laboratorio, e pertanto collettivamente costituiscono prove sperimentali da mettere a confronto con i risultati delle nostre simulazioni.
Sferoidi verranno ottenuti con cellule tumorali di diversa origine istotipica mediante tecnica di coltura su strato di agar secondo procedure in uso nel laboratorio. Le analisi morfologiche verranno effettuate al microscopio invertito utilizzando oculari micrometrici. La distribuzione delle cellule proliferanti, quiescenti e morte all'interno dello sferoide verra' studiata mediante tecniche istologiche standard, cosi' come la presenza di gradienti di nutrienti (es. glucosio) e di pH. In questo modo verranno misurati parametri sperimentali di importanza fondamentale per la validazione del simulatore.
Riferimenti bibliografici:
[Chignola&Milotti 2004] R.Chignola and E.Milotti, Physica A 338, 261 (2004)
[Chignola&Milotti 2005] R.Chignola and E.Milotti, Phys Biol 2, 8 (2005)
[Norton 1999] L.Norton, Semin Oncol 26, 11 (1999)
[Sutherland 1988] R.M.Sutherland, Science 240, 177 (1988)

Sponsors:

Ateneo
Funds: assigned and managed by the department
Syllabus: RICATENEO - Finanziamenti d'Ateneo per la Ricerca Scientifica

Project participants

Roberto Chignola
Associate Professor
Chiara Dalla Pellegrina

Collaboratori esterni

Edoardo Milotti
Universita' di Trieste Fisica Professore Associato
Alessio Del Fabbro
Istituto Nazionale di Fisica Nucleare - Sez. di Trieste Patologia contratto

Activities

Research facilities