Analisi del proteoma S-nitrosilato di Arabidopsis thaliana

Data inizio
1 settembre 2005
Durata (mesi) 
12
Dipartimenti
Biotecnologie
Responsabili (o referenti locali)
Delledonne Massimo

Nei sistemi animali, l’ossido nitrico (NO) rappresenta un’importante molecola segnale coinvolta nella regolazione di numerose funzioni cellulari. E’ oggi evidente che anche nelle piante NO rappresenta un’importante molecola segnale che regola numerosi processi, fra cui la risposta di resistenza alle malattie. Esso esercita la propria azione di molecola segnale ubiquitaria attraverso modifiche post-traduzionali di proteine, come la nitrosilazione (Stamler et al., 2001). NO ha infatti come bersaglio il gruppo tiolico delle cisteine e i centri di metalli di transizione per regolare un ampio spettro funzionale di substrati, che comprende le maggiori classi di proteine segnale nei mammiferi. L’obbiettivo del lavoro proposto è pertanto quello di fornire le evidenze sperimentali di questa modifica post-traduzionale basata sulla S-nitrosilazione in un sistema vegetale e di studiare il cambiamento nel profilo di proteine nitrosilate durante la risposta di resistenza alle malattie. L’identificazione delle proteine che sono suscettibili a queste modifiche aiuterà a comprendere le conseguenze funzionali e la rilevanza della S-nitrosilazione in almeno alcune delle condizioni fisiologiche e patofisiologiche delle piante.
Gli studi basati sulla proteomica rappresentano un potente complemento agli studi basati sulla trascrittomica perché permettono di analizzare le proteine espresse e le potenziali modificazioni post-trascrizionali, fra le quali spicca la S-nitrosilazione. Per rilevare e determinare il profilo delle proteine S-nitrosilabili negli estratti fogliari di Arabidopsis thaliana useremo un approccio di tipo proteomico adottato in collaborazione con il gruppo di proteomica dell’Università degli Studi di Verona (prof. Righetti). In breve, gli estratti proteici totali ottenuti da colture cellulari di Arabidopsis trattate con un donatore di NO saranno sottoposti ad un processo di marcatura delle proteine nitrosilate con il metodo del “biotin switch” (Jaffrey et al., 2001), in cui le cisteine nitrosilate sono convertite in cisteine biotinilate, bloccando precedentemente i tioli liberi con un agente metiltiolante tiolo specifico. Quindi, le proteine biotinilate saranno purificate applicando metodiche diverse volte alla massimizzazione del recupero delle proteine nitrosilate, quali l’utilizzo di neutravidina-agarosio oppure proteina A coniugata con un anticorpo anti-biotina. Dopo la separazione per affinità, le proteine purificate saranno sospese in un appropriato tampone per poi essere sottoposte ad elettroforesi bidimensionale. Le proteine S-nitrosilate saranno separate tramite elettroforesi in base alla carica (isoelettrofocalizzazione) usando strisce di gel formanti un gradiente immobilizzato non lineare di pH. L’uso di strip a ampio spettro (pH 3-10) permette la separazione della maggior parte delle proteine su di un singolo gel, mentre l’impiego di strip a spettro ridotto aumenta la capacità risolutiva del gel solamente in un ristretto valore di pH. Pertanto, strip di diversa dimensione e di diverso pH dovranno essere impiegate per la risoluzione fine del proteoma nitrosilato di Arabidopsis. La quantità di volt/ora sarà determinato empiricamente. Le strip saranno quindi equilibrate e caricate su SDS-PAGE dove le proteine saranno separate in base alla massa molecolare perpendicolarmente alla prima dimensione. Al fine di aumentare la risoluzione dei campioni proteici verranno impiegati sia gel a singola percentuale sia gel a gradiente di acrilamide, di lunghezza pari a 8,5 cm oppure 20 cm. In seguito, per visualizzare le proteine S-nitrosilate, i gel saranno colorati con un metodo appropriato. Verrà inizialmente impiegato il Comassie Brilliant Blue R-250. Nel caso siano richieste maggiori sensibilità, questo colorante sarà sostituito dal SYPRO Ruby protein gel staining (Bio-Rad) e/o dalla colorazione con argento.
Il metodo sarà validato infiltrando donatori di NO (SNP,GSNO) nelle foglie di Arabidopsis 1h e 3h prima dell’estrazione delle proteine. I controlli negativi consisteranno in campioni precedentemente trattati con agenti riducenti (DTT, GSH).

Risultati attesi:

Messa a punto di un sistema applicabile su larga scala per la purificazione selettiva e la separazione elettroforetica di proteine S-nitrosilate. Analisi del proteoma di Arabidopsis e rilevamento del set di proteine S-nitrosilabili.

Partecipanti al progetto

Massimo Delledonne
Professore ordinario

Attività

Strutture