Tecnologie biomolecolari (2008/2009)

Corso disattivato non visibile

Codice insegnamento
4S00175
Crediti
8
Coordinatore
Massimo Delledonne
L'insegnamento è organizzato come segue:
Modulo Crediti Settore disciplinare Periodo Docenti
Modulo 1 - Teoria 1 AGR/07-GENETICA AGRARIA 1° Sem Massimo Delledonne
Modulo 1 - Laboratorio 3 AGR/07-GENETICA AGRARIA 1° Sem Massimo Delledonne
Modulo 2 - Teoria 1 BIO/11-BIOLOGIA MOLECOLARE 1° Sem Barbara Molesini
Modulo 2 - Laboratorio 3 BIO/11-BIOLOGIA MOLECOLARE 1° Sem Barbara Molesini

Obiettivi formativi

Modulo: Modulo 2 - Teoria
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Fornire allo studente conoscenze approfondite riguardo la teoria dell'ibridazione tra acidi nucleici e la teoria della PCR, su cui trovano fondamento molte tecniche di biologia molecolare.


Modulo: Modulo 1 - Teoria
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Scopo del corso è quello di contribuire a fornire un’appropriata conoscenza delle metodiche molecolari e affinare le capacità dello studente di applicarle in situazioni concrete. L’obiettivo formativo primario è quindi rappresentato dall’apprendimento delle metodologie necessarie allo svolgimento delle più comuni pratiche di manipolazione del DNA che un biotecnologo sarà chiamato a svolgere. In particolare il corso tratta le principali tecniche di purificazione degli acidi nucleici, la loro separazione mediante elettroforesi, la manipolazione del DNA e le metodologie per clonaggio in vettori batterici, virali e di lievito.
E' prevista l'applicazione delle principali tecniche di purificazione del DNA plasmidico e genomico, la separazione del DNA mediante elettroforesi su gel di agarosio, la sua digestione con enzimi di restrizione, la preparazione di costrutti genici e la loro trasformazione in E. coli.


Modulo: Modulo 1 - Laboratorio
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Scopo del corso è quello di contribuire a fornire un’appropriata conoscenza delle metodiche molecolari e affinare le capacità dello studente di applicarle in situazioni concrete. L’obiettivo formativo primario è quindi rappresentato dall’apprendimento delle metodologie necessarie allo svolgimento delle più comuni pratiche di manipolazione del DNA che un biotecnologo sarà chiamato a svolgere. In particolare il corso tratta le principali tecniche di purificazione degli acidi nucleici, la loro separazione mediante elettroforesi, la manipolazione del DNA e le metodologie per clonaggio in vettori batterici, virali e di lievito.
E' prevista l'applicazione delle principali tecniche di purificazione del DNA plasmidico e genomico, la separazione del DNA mediante elettroforesi su gel di agarosio, la sua digestione con enzimi di restrizione, la preparazione di costrutti genici e la loro trasformazione in E. coli.


Modulo: Modulo 2 - Laboratorio
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La tecnica Southern-blot, basata sull'ibridazione tra acidi nucleici, e la metodica RT-PCR, basata sulla PCR, consentiranno allo studente di applicare concretamente, nell'analisi molecolare di piante transgeniche, le conoscenze acquisite nel modulo 2 di teoria.

Programma

Modulo: Modulo 2 - Teoria
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IBRIDAZIONE TRA ACIDI NUCLEICI
1.INTRODUZIONE ALL’IBRIDAZIONE TRA ACIDI NUCLEICI: FORZE CHE STABILIZZANO IL DNA, EFFETTI DEL pH E DELLA TEMPERATURA, TEMPERATURA DI MELTING (Tm), FATTORI CHE INFLUENZANO LA Tm
2.TIPI DI IBRIDAZIONE
3.IBRIDAZIONE IN SOLUZIONE: RIASSOCIAZIONE DEL DNA, PARAMETRI CHE INFLUENZANO LA RIASSOCIAZIONE/IBRIDAZIONE (FATTORI CHE INFLUENZANO LA VELOCITÀ DI FORMAZIONE DEGLI IBRIDI, FATTORI CHE INFLUENZANO LA STABILITÀ DEGLI IBRIDI)
4.IBRIDAZIONE SU FILTRO: TIPOLOGIE DI SUPPORTI E PROPRIETÀ, TRASFERIMENTO DI ACIDI NUCLEICI SU FILTRO, IMMOBILIZZAZIONE DEGLI ACIDI NUCLEICI SU FILTRO, SCREENING LIBRERIE RICOMBINANTI, DOT E SLOT BLOT, REVERSE DOT BLOT, SOUTHERN BLOT, NORTHERN BLOT (ESTRAZIONE DELL’RNA E GEL DENATURANTI)
5.SCELTA DELLA SONDA: DNA O RNA? SONDA RADIOATTIVA E NON RADIOATTIVA, MARCATURA DIRETTA E INDIRETTA, MARCATURA IN TUTTA LUNGHEZZA (NICK-TRANSLATION, RANDOM PRIMED LABELING, PCR-MEDIATED LABELING, RUN-OFF TRANSCRIPTION, METODI CHIMICI), MARCATURA TERMINALE AL 5’ E AL 3’ (T4 POLYNUCLEOTIDE KINASE, FILL-IN MEDIANTE KLENOW, DNA TAILING MEDIANTE TERMINAL DEOXYNUCLEOTIDYL TRANSFERASE), DETECTION DEGLI IBRIDI RADIOATTIVI (AUTORADIOGRAFIA), DETECTION DEGLI IBRIDI NON RADIOATTIVI (FOSFATASI ALCALINA, PEROSSIDASI, SUBSTRATI ENZIMATICI COLORIMETRIA E CHEMIOLUMINESCENZA)
6.ALCUNE APPLICAZIONI SPECIFICHE DELL’IBRIDAZIONE SU FILTRO: DNA MAPPING, DETECTION DI SEQUENZE OMOLOGHE, DNA FINGERPRINTING, DETECTION DI MUTAZIONI, DETECTION DI METILAZIONI.

PCR
1.DEFINIZIONE
2.MISCELA DI REAZIONE: EFFICIENZA, SPECIFICITA’, FEDELTA’
3.CICLO DI PCR. NUMERO FINALE DI MOLECOLE TARGET
4) 4.AMPLIFICAZIONE DEL PRODOTTO CORRETTO: VISUALIZZAZIONE E ANALISI DEI PRODOTTI DI PCR, COME EVITARE LE CONTAMINAZIONI (URACIL N-GLYCOSYLASE; UV; TRATTAMENTO ENZIMATICO), HOT START, NESTED PCR
5.TECNICHE E APPLICAZIONI: 5’RACE-PCR E 3’RACE-PCR, RT-PCR, PCR MUTAGENESI (DELEZIONE DI SEQUENZE, SOSTITUZIONE DI BASI, INSERZIONE DI SEQUENZE), MODIFICAZIONE DI PRODOTTI DI PCR (AGGIUNTA DI PROMOTORI, RIBOSOME-BINDING SITE, SITI DI RESTRIZIONE), UNIONE DI PRODOTTI DI PCR SOVRAPPOSTI “OVERLAPPING”, PCR QUANTITATIVA


Modulo: Modulo 1 - Teoria
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1- Concetti e tecniche di purificazione degli acidi nucleici
Purificazione del DNA
Preparazione DNA plasmidico
Preparazione DNA genomico
Preparazione DNA fagico

3- Separazione degli acidi nucleici mediante elettroforesi su gel di agarosio

4- Manipolazione del DNA e clonaggio
Caratteristiche e strategie d’uso dei vettori di clonaggio
Plasmidi
Cosmidi
Batteriofagi
Cromosomi artificiali di lievito (YAC)
Cromosomi artificiali batterici (BAC)
Clonaggio in E. coli
Digestione con enzimi di restrizione
Recupero frammenti DNA da gel di agarosio
Defosforilazione vettore
Ligatura
Preparazione cellule competenti
Trasformazione
Analisi cloni ricombinanti


Modulo: Modulo 1 - Laboratorio
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Preparazione DNA plasmidico
Preparazione DNA genomico
Separazione del DNA mediante elettroforesi su gel di agarosio
Digestione con enzimi di restrizione
Recupero frammenti DNA da gel di agarosio
Defosforilazione vettore
Ligatura
Preparazione cellule competenti
Trasformazione
Analisi cloni ricombinanti


Modulo: Modulo 2 - Laboratorio
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1) SOUTHERN BLOT ANALISI SU PIANTE TRANSGENICHE: ESTRAZIONE DNA GENOMICO, QUANTIFICAZIONE, TAGLIO CON ENZIMI DI RESTRIZIONE, SEPARAZIONE DEI FRAMMENTI SU GEL DI AGAROSIO, TRASFERIMENTO SU SUPORTO SOLIDO PER CAPILLARITÀ, IMMOBILIZZAZIONE DEL DNA SUL FILTRO, MARCATURA DEL PROBE NON RADIOATTIVO, PREIBRIDAZIONE, IBRIDAZIONE, LAVAGGI, DETECTION DEGLI IBRIDI MEDIANTE CHEMIOLUMINESCENZA, ANALISI DEI RISULTATI

2) RT-PCR: ESTRAZIONE RNA, QUANTIFICAZIONE, TRATTAMENTO CON DNase, SINTESI DI cDNA, PCR

Modalità d'esame

Modulo: Modulo 2 - Teoria
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esame scritto


Modulo: Modulo 1 - Teoria
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Valutazione del grado di preparazione mediante colloquio


Modulo: Modulo 1 - Laboratorio
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Valutazione del grado di preparazione mediante colloquio


Modulo: Modulo 2 - Laboratorio
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Consegna di una relazione dettagliata sulle esperienze svolte in laboratorio