Tecniche di colture cellulari (2008/2009)

Corso a esaurimento (attivi gli anni successivi al primo)

Codice insegnamento
4S00096
Crediti
6
Coordinatore
Antonella Furini
L'insegnamento è organizzato come segue:
Modulo Crediti Settore disciplinare Periodo Docenti
Mod. cellule animali (teoria) 2 BIO/13-BIOLOGIA APPLICATA 2° Sem Roberto Chignola
Mod. cellule vegetali (teoria) 2 AGR/07-GENETICA AGRARIA 2° Sem Antonella Furini
Mod. cellule vegetali (laboratorio) 2 AGR/07-GENETICA AGRARIA 2° Sem Antonella Furini

Obiettivi formativi

Modulo: Mod. cellule vegetali (teoria)
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Il corso introduce i concetti generali delle colture cellulari vegetali. Tratta l'utilizzo di ormoni per il differenziamento e dedifferenziamento delle colture in vitro. Obiettivo del corso è altresì l'applicazione biotecnologica delle colture cellulari come la trasformazione genetica e la produzione di proteine eterologhe.


Modulo: Mod. cellule vegetali (laboratorio)
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L'obiettivo del lavoro di laboratorio è quello di apprendere le tecniche di colture in vitro, dalla preparazione dei mezzi di coltura alla sterilizzazione degli espianti, alla trasformazione genetica


Modulo: Mod. cellule animali (teoria)
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Scopo del corso e’ fornire allo studente una panoramica delle moderne tecniche di coltura delle cellule animali e dell’utilizzo delle colture per la produzione e per la valutazione dell’attivita’ biologica di molecole di interesse biotecnologico. Il corso intende inoltre fornire allo studente alcuni cenni sull’uso delle colture cellulari in biomedicina con particolare riferimento alle colture delle cellule staminali.

Programma

Modulo: Mod. cellule vegetali (teoria)
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Organizzazione del laboratorio; coltura asettica e metodi di sterilizzazione. Cappa a flusso laminare, camera di crescita e controllo dei fattori ambientali.
Composizione dei mezzi di coltura. Preparazione degli espianti, sterilizzazione, inoculo e trasferimenti. Influenza del tipo di espianto sulla crescita e lo sviluppo. Trasferimento dal mezzo di coltura al suolo.
Embriogenesi somatica. Differenziamento e dedifferenziamento in vitro. Organogenesi diretta e indiretta. Coltura di calli e di cellule in sospensione. Coltura di protoplasti e ibridi somatici. Produzione di aploidi in vitro, micropropagazione e variazione somaclonale.
Trasformazione genetica. Trasformazione con Agrobatterio, con metodo biolistico e per infiltrazione. Piante transgeniche e impatto ambientale. Produzione di proteine eterologhe.


Modulo: Mod. cellule vegetali (laboratorio)
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Sterilizzazione e coltura in vitro di semi. Embriogenesi somatica da colture di ipocotili. Micropropagazione. Preparazione dei protoplasti. Trasformazione genetica di Arabidopsis e tabacco. Analisi molecolare delle piante transgeniche.


Modulo: Mod. cellule animali (teoria)
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• La cellula animale
• Vantaggi e svantaggi delle colture di cellule animali rispetto alla sperimentazione con animali
• Colture primarie e il limite di Hayflick
• Trasformazione cellulare per l’ottenimento di linee stabilizzate
• Strumentazione e reagenti per le colture di cellule animali. Composizione dei principali terreni. Sieri animali e terreni sintetici.
• La contaminazione delle colture. Il rischio biologico associato alla manipolazione di cellule umane e le fondamentali procedure biohazard da utilizzare nel laboratorio
• Modelli qualitativi e quantitativi per la sperimentazione. Cenni sulla teoria statistica di Poisson. Applicazioni della teoria di Poisson negli esperimenti di diluizione limite
• Clonaggio di cellule per la produzione di anticorpi monoclonali. Quantificazione delle plasmacellule in vivo. Quantificazione del potenziale clonogenico di una popolazione di cellule tumorali
• Coltura di cellule su feeder layer. Colture massive in mini-bioreattori per la produzione di anticorpi monoclonali e di proteine in genere.
• Tecniche di immunofenotipizzazione.
• Tecniche fluorimetriche e strumentazione per l’analisi della fluorescenza: il citofluorimetro, la microscopia confocale e la fluorimetria per micropiastre
• Preparazione ed esecuzione di un esperimento con cellule animali: conta cellulare e stima della vitalita’ del campione, saggi di citotossicita’, misure della morte cellulare programmata e della necrosi
• Uso di cellule umane differenziate o differenziabili in vitro. Misure elettriche e di permeabilita’
• Coltura di cellule tumorali in 3 dimensioni: morfologia e proprieta’, saggi di citotossicita’
• Cellule staminali embrionali ed adulte. Tecniche di isolamento e purificazione e loro possibili applicazioni

Modalità d'esame

Modulo: Mod. cellule vegetali (teoria)
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Prova orale e relazione scritta relativa ai risultati ottenuti dagli esperimenti di laboratorio.


Modulo: Mod. cellule vegetali (laboratorio)
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Modulo: Mod. cellule animali (teoria)
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Alla fine del corso lo studente dovra’ sostenere un esame scritto a “domande aperte”