Biopolymers and NMR analysis (2005/2006)

Course partially running

Course code
4S00204
Name of lecturer
Henriette Molinari
Number of ECTS credits allocated
5
Academic sector
CHIM/06 - ORGANIC CHEMISTRY
Language of instruction
Italian
Location
VERONA
Period
Second semester dal Mar 1, 2006 al Jun 9, 2006.

Lesson timetable

Second semester
Day Time Type Place Note
Tuesday 2:30 PM - 4:30 PM lesson Laboratory Gamma from Mar 7, 2006  to Jun 9, 2006
Thursday 2:30 PM - 4:30 PM lesson Laboratory Gamma from Mar 7, 2006  to Jun 9, 2006

Learning outcomes

Lo scopo di questo corso è di fornire agli studenti la conoscenza dei metodi di indagine nel
campo della biologia strutturale, metodi volti alla comprensione, a livello molecolare, della
correlazione tra struttura e funzione di macromolecole biologiche. Il corso si divide in due
parti, una dedicata all’analisi delle strutture proteiche e dei determinanti del folding, in cui lo studente, oltre ai principi base della struttura delle proteine, dovrebbe apprendere a
maneggiare programmi standard di visualizzazione e analisi di biomolecole ed essere in grado
di modellare proteine di struttura non nota sapendo scegliere opportuni templati. La seconda
parte è dedicata all’apprendimento dei principi fisici di base della risonanza Magnetica
Nucleare applicata allo studio di proteine imparando anche ad eseguire semplici esperimenti.

Syllabus

Introduzione alla strutura di proteine: Sequenze - struttura - funzione.
Catene polipeptidiche: Legame peptidico. Amminoacidi: Proprieta' idrofobiche e polari, gruppi
titolabili e influenza dell'ambiente proteico. Struttura primaria, secondaria, terziaria, quaternaria.
Angoli di torsione della catena principale. Diagramma di Ramachandran: derivazione standard per
glicina e X-prolina. Classificazione dell’architettura e della topologia delle strutture proteiche.
Determinazione delle superficie accessibile al solvente. Effetti elettrostatici. Triadi catalitiche e
meccanismi di azione.
Alfa-elica, geometria, proprieta' topologiche. Eliche 3_10 e pi greca. Motivi di terminazione delle
eliche:N-cap box e statistica. Rassegna dei motivi N-term e C-term.
Strutture estese: Strutture a foglietto beta. Foglietti beta paralleli e antiparalleli. Proprieta'.
Preferenze conformazionali. Beta-hairpin e tight turns.Gamma turns e turns di tipo I-VII e mirror
images. Beta-bulges, classici, wide e G1.
Strutture supersecondarie (motivi strutturali):proprieta' strutturali e di funzione. Helix-loop-helix,
helix-turn-helix, EF-hand. Beta-hairpin e beta-alpha-beta.
Domini delle proteine: Classificazione dei domini. Strutture a dominio alpha. Esempi: four-helix
bundle. Globin fold. Principi di impaccamento delle eliche. Strutture alpha/beta. Strutture a TIM
barrel e a foglietto aperto. Strutture beta antiparallele. Strutture a barile jelly-roll. Siti funzionali e
funzione. Impaccamento dei residui del core e profili. Considerazioni sull'evoluzione delle
sequenze. Topological switch points e siti di legame
La protein Data Bank. Files di struttura. Come recuperare i files dal sito della PDB.
Solubilità delle proteine: serie di Hoffmeister, salting in e salting out. Aspetti termodinamici
Principi di modelling molecolare
Modelling Molecolare: apprendimento e utilizzo dei programmi SPDBviewer, MOLMOL,
WHATIF, per l’analisi delle strutture e la costruzione di modelli.
Problema del protein folding
Risonanza Magnetica Nucleare applicata allo studio di proteine
Introduzione alla Risonanza Magnetica Nucleare: Radiazione elettromagnetica, assorbimento ed
emissione di fotoni. Condizione di Bohr. Spin e momento magnetico. Spin nucleari. Energia di uno
spin in un campo magnetico. Moto di precessione. Effetti macroscopici. Sistema di riferimento
rotante. Effetto di un campo a radiofrequenza nel rotating frame. Campo efficace. Condizione di
risonanza. Eccitazione e rivelazione in un apparecchio NMR. Impulsi a radio frequenza. Flip angle.
Moti molecolari e campi fluttuanti. Rilassamento verso l'equilibrio. Fenomeni di tipo T1 e di tipo
T2. Equazioni di Bloch. Precessione libera. Profilo di eccitazione di un impulso. Relazione fra
durata di un impulso e banda eccitata. Impulsi forti. Saturazione. Descrizione di uno spettrometro
NMR. Schema generale. Il magnete. Il trasmettitore e gli amplificatori. Il lock. Il ricevitore. La
demodulazione e la quadratura. Digitalizzazione e range dinamico. Trasformata di Fourier.
Notazione complessa. Lorentziana. Segnali campionati nel tempo. Intervallo di campionamento e
larghezza di banda.
Esercitazioni allo spettrometro. Tuning e matching. Lock. Shimming. Calibrazione dell'impulso a
90 gradi. Presaturazione.
Esperimenti NMR monodimensionali. Chemical shifts. Chemical shift secondari nella
determinazione strutturale di proteine. Introduzione al rilassamento. Tempo di correlazione. Effetto
Overhauser nucleare. Misura dei parametri di rilassamento. Misure dei moti proteici che avvengono
su scale di tempo picosecondi-millisecondi.
Esperimenti NMR multidimensionali: parametri importanti per la seconda dimensione temporale.
Analisi di dati 2D. Sistemi di spin degli ammino acidi. Esperimenti di tipo COSY e TOCSY.
Strategia di assegnamento di uno spettro di una proteina. Assegnazione sequenziale. Vincoli
strutturali e derivazione di strutture rappresentative.
Esperimenti multinucleari multidimensionali
Metodi di overespressione ed arricchimento di sistemi proteici per la biologia strutturale.
Produzione da E.coli e da lieviti. La scelta del sistema e del mezzo minimo.
Calcolo di una struttura tridimensionale: Inclusione di vincoli NMR in campi di forze. Simulazioni
vincolate. Simulated Annealing, minimizzazioni. Strutture NMR. Analisi di insiemi di strutture.
RMSD medi.
NMR e protein folding
Esercitazioni allo spettrometro 500 MHz NMR situato nei locali dell’Università di Verona

Assessment methods and criteria

L’esame consiste nella presentazione e discussione di un articolo che viene assegnato durante
il corso. Lo studente deve dimostrare di aver capito le basi scientifiche, il lavoro svolto e
l’innovazione eventualmente rappresentata da quel particolare lavoro. Verrà curata molto la
presentazione dell’articolo stesso, in quanto l’esame vuole essere uno strumento per imparare
a presentare i risultati del proprio lavoro.

Studying