Pubblicazioni

Autori:

Avanzato, Carla Giuseppina

Titolo:

Optimization of library preparation methods to improve RNA-Sequencing analysis

Anno:

2016

Tipologia prodotto:

Doctoral Thesis

Tipologia ANVUR:

Altro

Lingua:

Inglese

Parole chiave:

New Generation Sequencing, RNA-Sequencing, gene expression, annotation, library preparation

Abstract (italiano):

L’ arrivo del Sequenziamento di Nuova Generazione ha rivoluzionato il mondo della transcrittomica, permettendo l’affermarsi dell’ RNA-Sequencing (RNA-Seq), che in breve tempo ha soppiantato i precedenti microarrays e le altre tecniche basate sul sequenziamento Sanger. Un esperimento di RNA-Seq, dopo essere stato messo a punto ed avvenuta l’estrazione dell’ RNA, prevede: una fase di “selezione” in cui vengono scartati gli rRNA che costituiscono la componente piu’ abbondante del trascrittoma, ma inutile per questo tipo di analisi, la fase successiva e’ la produzione di una libreria di cDNA. I metodi standard di produzione delle librerie non ci permettono di capire da quale strand del DNA il trascritto viene codificato;tuttavia sono stati sviluppati metodi per la produzione di librerie direzionali grazie alle quali e’ possibile capire lo strand di provenienza di ogni trascritto. Ad ogni modo, il metodo di Selezione dell’ RNA e di preparazione della libreria dipendono dall’ obbiettivo finale e dovrebbero essere scelti con estrema attenzione prima di iniziare l’ esperimento. Lo scopo di questo lavoro e’ quello di ottimizzare i protocolli di produzione delle librerie al fine di trovare il metodo piu’ efficiente per rispondere alle esigenze e domande di ogni progetto di ricerca. Trovare quindi, una strategia che permetta di rispondere al quesito biologico in questione, e di farlo utilizzando budget e tempistiche disponibili. All’ inizio di questo lavoro e’ stato ottimizzato il protocollo del kit TruSeq RNA dell’ Illumina, in modo da rendere la produzione delle librerie il piu’ veloce ed efficiente possibile. I cambiamenti al protocollo sono stati apportati nelle seguenti fasi: tempo di frammentazione, numero dei cicli di PCR, tempo di incubazione delle Ampure XP beads (utilizzate per purificare) e inoltre, per le librerie che andranno sequenziate in Paired – Ends, e’ stata aggiunta una fase di size selection finale. Successivamente sono state confrontate reads prodotte da sequenziamento in Paired – ends (PE) e Single – ends (SE) per capire se, per studi di analisi di espressione differenziale, fosse necessario il sequenziamento in PE. Infatti, nell’analisi di espressione differenziale e’ necessario utilizzare almeno 3 replicati per ogni condizione; questo comporta un costo molto elevato, specialmente quando si sequenzia in PE. Certamente, le reads prodotte dal sequenziamento in PE permettono una piu’ completa e accurata ricostruzione del trascrittoma e, quindi, dovrebbero essere sempre utilizzate quando si lavora con specie per le quali non c’e’ un genoma o trascrittoma di riferimento e deve essere fatto un assemblaggio de-novo. Tuttavia, la nostra comparazione mostra che i dati prodotti dal sequenziamento in PE e SE degli stessi campioni, producono un ugual numero di frammenti mappanti e hanno livelli di espressione altamente correlati. Per cui, possiamo affermare che il sequenziamento in SE e’ sufficiente ed economico nei casi in cui lo scopo del progetto e’ la misura dell’ espressione genica. Nella seconda parte di questo lavoro e’ stata dimostrata la superiorita’ delle librerie direzionali, poiche’ solo con il loro utilizzo si possono ben distinguere due o piu’ geni sovrapposti. Le librerie direzionali sono poi state utilizzate in due progetti in cui lo scopo principale era quello di utilizzare i dati RNA-Seq per fare annotazione genica. Nel primo caso, per l’annotazione del genoma della Melanzana (Solanum melongena), sono state prodotte e sequenziate in PE 20 librerie direzionali. Nel caso invece dell’ annotazione di Nebbiolo (Vitis vinifera cultivar), in cui si aveva a disposizione un budget limitato, 28 differenti campioni sono stati uniti e dal pool e’ stata prodotta una sola libreria direzionale, che e’ stata normalizzata tramite trattamento con Duplex Specific Nuclease (DSN) prima di essere sequenziata, al fine di abbas

Id prodotto:

91773

Handle IRIS:

11562/939877

ultima modifica:

26 ottobre 2022

Citazione bibliografica:

Avanzato, Carla Giuseppina, Optimization of library preparation methods to improve RNA-Sequencing analysis

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