Quantificazione degli inibitori delle alfa-amilasi di frumento nelle farine e nelle polveri ambientali

Data inizio
5 settembre 2005
Durata (mesi) 
12
Dipartimenti
Biotecnologie
Responsabili (o referenti locali)
Rizzi Corrado

Le piante hanno sviluppato delle strategie di difesa verso i predatori basate sulla produzione di molecole di natura proteica e non, in grado di inibire l’attività degli enzimi secreti dall’apparato digerente degli insetti e degli animali superiori tra cui anche dell’uomo (Garcia-Olmedo G. et al., 1987 Plant. Mol. Cell. Biol.). Per questo motivo, gli inibitori delle alfa-amilasi espressi nei vegetali rappresentano un potenziale mezzo per indurre resistenza contro parassiti nelle piante coltivate (Sharma H.C. et al., 2000 E.J.Biotechnology).
Gli inibitori proteici dell’alfa-amilasi esogena dei cereali vengono generalmente classificati a seconda della loro struttura quaternaria in: monomerici, dimerici e tetramerici (Feng G.H. et al., 1996 Insect Biochem. Biol.). Sono proteine composte da 120-160 aminoacidi per ogni subunità, e ognuna di queste è molto simile per struttura e peso molecolare. In particolare, ogni subunità ha un peso di circa 12-15 kDa ed ha cinque ponti disolfuro che ne stabilizzano la struttura secondaria (Maeda K. et al., 1983 Biochim. Biophys. Acta). Tuttavia la classificazione di queste proteine è particolarmente complessa soprattutto per il fatto che esse vengono chiamate con nomi diversi in lavori pubblicati da differenti gruppi di ricerca.
Gli inibitori monomerici sono stati ampiamente studiati. La prima proteina ad essere stata isolata mostra una mobilità elettroforetica relativa pari a 0.28 ed è stata nominata WMAI-1. Successivamente sono state isolate altre proteine che hanno caratteristiche simili. Due di queste isoforme, indicate come WRP25 e WRP26, differiscono in sequenza l’una dall’altra soltanto per due residui aminoacidici e sono caratterizzati da un’altissima omologia con l’inibitore 0.28. Un’altra isoforma, WRP27, possiede una sequenza distinta da quelle delle ultime due menzionate e bassa omologia anche con lo 0.28, tuttavia un’analisi della velocità di sedimentazione ne ha confermato la natura monomerica (Feng et al., 1995).
Gli inibitori dimerici sono identificati con la sigla WDAI (Wheat Dimeric Amylase Inhibitors) oppure con un numero indicante la loro mobilità in elettroforesi basica. Tra gli omodimeri accertati ci sono tre isoforme: WDAI-1 (0.53), WDAI-2 (0.19) e WDAI-3 (Sanchez-Monge et al., 1989).
Gli inibitori tetramerici vengono spesso identificati con la sigla WTAI (Wheat Tetrameric Amylase Inhibitors), ma sono anche noti con il nome di “CM-proteins” in quanto solubili in miscele di cloroformio e metanolo, utilizzati per l’estrazione dalle farine (Svensson et al., 1999). Attualmente sono conosciute sette subunità denominate CM1, CM2, CM3A, CM3B, CM3D, CM16 (Gomez A. et al. 1989 Proc. Natl. Sci. USA). Di quest’ultima isoforma di 16 kDa esiste una variante omologa glicosilata. Questa N-glicosilazione sembrerebbe implicata nel rendere questo peptide uno degli allergeni inalatori più potenti delle farine di frumento, riconosciuta dalla maggior parte delle IgE dei soggetti affetti da asma del panificatore (Sanchez-Monge et al., 1992).
Tutte le subunità indicate si possono combinare tra loro a formare degli eterotetrameri, ma non tutte le combinazioni sono consentite .
Negli estratti di farina di grano duro (T. turgidum) sono presenti soltanto due isoforme degli inibitori dimerici dell’alfa-amilasi, ossia lo 0.53 e WDAI-3; mentre negli estratti di farina di grano tenero (T. aestivum) è presente anche l’inibitore 0.19: questo infatti è codificato dal genoma D. Gli inibitori dimerici sono gli unici in grado di inibire l’alfa-amilasi proveniente da mammiferi, anche se in modo diverso l’uno dall’altro.
Per esempio, l’inibitore 0.19 sembra essere quello con spettro d’azione più ampio, infatti è attivo contro alfa-amilasi di mammifero come quella salivare umana (HSA) e pancreatica porcina (PPA), oltre che contro amilasi da diversi tipi di insetti (tra cui Tenebrio molitor) e batteri (Bacillus subtilis). Ha un peso molecolare di 26.6 kDa ed è costituito da due subunità identiche di 13.3 kDa, ciascuna composta da 124 amminoacidi (Oneda H. et al. J. Biochem, 2004).
L’inibitore 0.53 sembra essere anch’esso attivo contro alfa-amilasi derivanti da mammifero, ma in misura minore rispetto a 0.19, soprattutto per quel che riguarda la PPA, nonostante abbiano una omologia di sequenza del 94% (Svensson B. et al., Biochim. Biophys. Acta 2003; Franco O.L. et al., Eur. J. Biochem. 2000). Alcuni lavori di letteratura riportano che l’inibitore 0.53 ha la capacità di agire contro alfa-amilasi di molti tipi di insetto (come Callosobruchus maculatus, Zabrotes subfasciatus, Acanthoscelides obtectus e Tenebrio molitor) e, in base a questa sua peculiarità, viene indicato come proteina idonea da far esprimere in piante geneticamente ingegnerizzate per fornire protezione contro i parassiti, senza però fungere da fattore antinutrizionale per i consumatori di tali piante, in particolare per l’uomo (Franco O.L. et al., Eur. J. Biochem. 2000).
Tuttavia, bisogna tuttavia tenere presente che queste proteine sono non solo possono agire come fattori antinutrizionali per i mammiferi e per l’uomo (Svensson B. et al., Biochim. Biophys. Acta 2003) ma posseggono anche un’altra attività biologica: sono i maggiori allergeni implicati nella malattia professionale, nota come asma del panificatore (Franco O.L. et al., Eur. J. Biochem. 2000).
L’allergia respiratoria IgE-mediata ai cereali è un fenomeno patologico che si manifesta, in soggetti sensibilizzati, essenzialmente dopo inalazione o contatto con farine. La reazione di ipersensibilità può manifestarsi con segni e sintomi diversi e di intensità variabile (asma, rinite). Mancano, tuttavia, informazioni sul rischio allergologico professionale da esposizione a farine. Questo rischio dovrebbe essere valutato in base ai livelli espositivi di polverosità della farina negli ambienti di lavoro e soprattutto del contenuto di allergeni presenti nelle differenti frazioni di polvere. Fino ad ora non sono disponibili metodiche validate di rilevazione degli allergeni nelle polveri di farina di cereali. Si rende quindi necessario fornire dati certi, a tutela della salute del lavoratore e del consumatore, sul reale potere sensibilizzante e di allergenicità dei diversi cereali.
In particolare con questo progetto si cercherà, in una prima fase, di identificare il potenziale allergenico di alcune di queste proteine. A questo fine gli inibitori delle alfa-amilasi di frumento verranno frazionati con consolidate tecniche di precipitazione frazionata e di cromatografia (Feng G.H. et al, 1996 Insect Biochem. Molec. Biol.). Successivamente si procederà, utilizzando come reattivi pool di sieri di panificatori asmatici (forniti dalla Medicina del Lavoro Azienda Ospedaliera Verona Dipartimento di Medicina e Sanità Pubblica, Sezione di Medicina Legale e Medicina del Lavoro, Università di Verona), alla identificazione di quegli inibitori delle alfa-amilasi di frumento maggiormente riconosciuti dalle IgE dei panificatori asmatici. Verso questi inibitori si svilupperanno sieri specifici in coniglio e anticorpi monoclonali, in collaborazione con il laboratorio di Immunologia ed Oncologia Sperimentale del Dipartimento Scientifico e Tecnologico dell’Università di Verona. Dopo la caratterizzazione, utilizzando questi anticorpi si metterano a punto tecniche di immunorivelazione per la quantificazione degli inibitori delle alfa-amilasi in diversi campioni di farina e in campioni di poveri ambientali che verranno fornite dalla Medicina del Lavoro dell'Azienda Ospedaliera di Verona.
In questo modo ci si auspica di poter mettere a punto sistemi di stima del contenuto di allergeni nelle frazioni di polverosità ambientale.

Enti finanziatori:

Ateneo
Finanziamento: assegnato e gestito dal Dipartimento
Programma: RICATENEO - Finanziamenti d'Ateneo per la Ricerca Scientifica

Partecipanti al progetto

Silvia Mosconi
Corrado Rizzi
Ricercatore
Gianni Zoccatelli
Professore associato

Attività

Strutture

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