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Authors:

Civiero, Laura

Title:

Heterologous expression of three enzymes forstructural studies

Year:

2010

Type of item:

Doctoral Thesis

Tipologia ANVUR:

Altro

Language:

Inglese

Keyword:

protein expression and purification; structural studies

Abstract (italian):

In questo lavoro di tesi ci si è occupati dell’espressione, della purificazione e della cristallizzazione di tre enzimi (bile acid CoA:amino acid N-acyltransferase, BAAT; farnesyl cysteine-carboxyl methyltransferase, Ste14; e stearoyl-CoA desaturase, SCD) con lo scopo finale di determinarne la struttura tridimensionale mediante analisi di diffrazione di raggi X. I cDNA delle proteine in questione sono stati clonati in vettori per l’espressione in sistemi eterologhi. Le scelta del sistema di espressione opportuno per la produzione su larga scala è stata condotta dopo una valutazione della resa, della stabilità ed integrità del prodotto proteico. La proteina BAAT umana è stata espressa utilizzando il sistema procariotico E.coli. La proteina ricombinante è stata purificata tramite due cromatografie di affinità al nichel e gel filtrazione. L’integrità del campione ottenuto è stata controllata attraverso spettrometria di massa e l’omogeneità mediante DLS. E’ stata condotta anche una valutazione dell’attività enzimatica verificando la presenza dei prodotti mediante spettrometria di massa. Oltre alla proteina wild type è stato prodotto il mutante privo di attività enzimatica (C235A) per procedere con le prove di cristallizzazione in presenza del substrato. I campioni ottenuti si presentano sufficientemente puri, stabili ed omogenei per allestire le prove di cristallizzazione. Le prove di cristallizzazione hanno dato esito positivo con la proteina mutata, anche se i cristalli fino ad ora ottenuti non sono idonei per gli esperimenti di diffrazione di raggi X. La proteina di membrana Ste14 di C.glabrata è stata individuata come buon candidato per la produzione su larga scala al fine di condurre studi strutturali attraverso l’utilizzo di un sistema high-throughput pubblicato da Drew et al., 2008. Il sistema prevede l’espressione eterologa in S. cerevisiae; la proteina di interesse viene prodotta in fusione alla GFP permettendo la valutazione del livello di espressione e la stabilità nei diversi detergenti attraverso misure di fluorescenza sull’estratto cellulare. L’enzima è stato purificato attraverso due cromatografie di affinità al nichel e gel filtrazione in presenza sia del detergente DDM sia del detergente LDAO. Il profilo della gel filtrazione suggerisce che il campione è ‘monodisperso’ e quindi adeguato per l’allestimento di prove di cristallizzazione. Ad oggi non sono però stati ottenuti cristalli adatti ad esperimenti di diffrazione. E’ stato infine messo appunto un protocollo di espressione e purificazione per l’enzima transmembrana umano SCD. La proteina ricombinante è stata espressa in cellule di insetto e purificata in presenza del detergente DDM attraverso IMAC. La resa e la purezza del prodotto proteico ad oggi non è ancora ottimale ma la quantità di enzima è sufficiente per allestire prove di cristallizzazione e per condurre studi biochimici e strutturali.

Product ID:

57069

Handle IRIS:

11562/344018

Last Modified:

November 15, 2022

Bibliographic citation:

Civiero, Laura, Heterologous expression of three enzymes forstructural studies

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