Emoglobine vegetali esacoordinate: ruolo dei residui distali della tasca di legame dell'eme

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Starting date
October 1, 2005
Duration (months)
12
Departments
Biotechnology
Managers or local contacts
Dominici Paola

Le emoglobine (Hb) sono presenti in un’ampia varietà di organismi, dai batteri agli eucarioti unicellulari, fino alle piante e agli animali. Le emoglobine di pianta sono state classificate in simbiotiche e non simbiotiche. Le Hb non simbiotiche (nsHb) sono state scoperte di recente e si pensa siano precedenti nell’evoluzione alle più specializzate legemoglobine. Le nsHb mostrano una peculiare
esacoordinazione dell’eme, risultante da due residui di istidina che legano l’atomo di Fe nel quinto e nel sesto sito di coordinazione, quest’ultimo essendo il tradizionale sito di legame per l’O2 ed altri ligandi. Nonostante la potenziale inibizione del legame con ligandi esogeni, le nsHb legano O2 ed altri ligandi con affinità molto elevate. Si conosce molto poco della funzione delle nsHb, sebbene si sia proposto il loro coinvolgimento in una o più delle seguenti vie metaboliche: i) rimozione dell’O2; ii) partecipazione in un processo di electron transfer mediante l’interazione con una flavina; iii) legame di O2, NO e CO come parte di un meccanismo sensoriale e/o di difesa; iv) legame a piccole molecole organiche e partecipazione alla sintesi di composti organici in condizioni anaerobiche.
Arabidopsis thaliana possiede due nsHb, AHb1 e AHb2. Le loro proprietà biologiche suggeriscono che possano avere differenti funzioni. AHb1 viene fortemente indotta da condizioni di ipossia, il ché suggerisce che sia una proteina indotta dallo stress. E’ stato proposto che AHb1 funzioni come una NO-diossigenasi, che metabolizza l’NO a nitrato. AHb2 viene espressa a bassi livelli nelle
foglie e viene indotta da stress da freddo. I pochissimi dati sui meccanismi funzionali e le caratteristiche strutturali di AHb1 e AHb2 non consentono di tracciare un quadro chiaro del ruolo fisiologico di queste proteine. Esperimenti sistematici sulle proprietà strutturali e funzionali di AHb1 ed AHb2 sono pertanto necessari per poter arrivare a suggerire quali siano i loro ruoli funzionali.


L'obiettivo del presente progetto e' quello di mutare selettivamente specifici residui in Ahb1 ed Ahb2 allo scopo di delucidare le basi molecolari della loro elevata affinita' per l'O2 e ottenere informazioni sulle caratteristiche strutturali della tasca di legame dell'eme, con l'obiettivo di correlare queste informazioni alla possibile funzione biologica di tali proteine.
Il nostro gruppo di ricerca ha recentemente clonato, espresso in E. coli e purificato all'omogeneita' sia Ahb1 che Ahb2.
Le cinetiche di legame delle Hb dei non vertebrati sono fortemente influenzate dalla struttura della cavita' dell'eme; in particolare la dimensione e la polarita' dei residui che occupano la porzione distale esercitano effetti sterici e dielettrici .
Le Hb (e Mb) dei vertebrati hanno His e Leu alla posizione distale E7 e B10, rispettivamente, con l'His capace in alcuni casi di stabilire un legame a idrogeno con l'O2 legato , stabilizzando in tal modo la struttura ossigenata . In molte Hb dei non vertebrati, i residui E7His e B10Leu sono sostituiti rispettivamente da Gln e Tyr/Phe, con il risultato di creare un ristretto spazio per l'O2 ed affinita' di legame molto maggiori rispetto alla globine dei vertebrati. Le nsHb , che mostrano gli stessi residui E7His e B10Tyr/Phe nel sito distale, possiedono elevata affinita' per l'O2 , dovuta principalmente alle basse costanti di dissociazione. Si ritiene che l'elevata affinita' sia anche dovuta alla stabilizzazione del ligando mediante un legame a H con l'E7His. Infatti, la mutazione di HisE7Leu nella nsHb di riso, aumenta di circa 1000 volte la costante di dissociazione .
Abbiamo in programma la mutazione di PheB10Leu con l'obiettivo di studiare l'effetto di tale sostituzione sull'interazione con NO, CO ed O2.
L'allineamento delle sequenze di Ahb2 con Ahb1 e altre Hb vegetali, indica, tra l'altro, interessanti differenze al sito distale dell'eme, che risulta globalmente piu' ricco di aminoacidi polari carichi. In particolare, AHb2 presenta un residuo di Lys (Lys69E10) non conservato in AHb1 e nelle sequenze di altre nsHb, ma presente al sito distale di numerose leghemoglobine e di un'altra Hb esacoordinata, la neuroglobina umana, che,in assenza dell'HisE7, sembra essere in grado di coordinare il Fe dell'eme a pH alcalini e contribuire al legame di ligandi . L'appropriata mutazione di tale residuo e l'analisi della proteina mutata consentira' di aquisire importanti informazioni sulle caratteristiche strutturali e funzionali del sito distale delle due ns Hb da Arabidopsis. Lys69E10 in Ahb2 sara' mutata con un residuo polare ma non dissociabile , come Thr o Ser (quest'ultima presente in E10 di AHb1) e le caratteristiche della proteina mutata saranno studiate.

Sponsors:

Ateneo
Funds: assigned and managed by the department
Syllabus: RICATENEO - Finanziamenti d'Ateneo per la Ricerca Scientifica

Project participants

Paola Dominici
Full Professor
Research areas involved in the project
Proteomica strutturale, funzionale e di espressione
Biochemistry & Molecular Biology  (DBT)
Biochimica e Biologia Molecolare
Biochemistry & Molecular Biology  (DBT)  (DBT)
Proteomica strutturale, funzionale e di espressione
Biochemistry & Molecular Biology  (DM)  (DM)
Biochimica e Biologia Molecolare
Biochemistry & Molecular Biology  (DM)  (DM)
Proteomica strutturale, funzionale e di espressione
Biochemistry & Molecular Biology  (DNBM)  (DNBM)
Biochimica e Biologia Molecolare
Biochemistry & Molecular Biology  (DNBM)  (DNBM)
Proteomica strutturale, funzionale e di espressione
Biochemistry & Molecular Biology  (DSVR)  (DSVR)
Biochimica e Biologia Molecolare
Biochemistry & Molecular Biology  (DSVR)

Activities

Research areas

Research groups

PhD Programmes

Research facilities

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