Metodologie biomolecolari e genetiche (2020/2021)



Codice insegnamento
4S008190
Crediti
12
Coordinatore
Antonella Furini
Settore disciplinare
AGR/07 - GENETICA AGRARIA
Lingua di erogazione
Italiano
L'insegnamento è organizzato come segue:
Attività Crediti Periodo Docenti Orario
teoria 6 II semestre, I semestre Linda Avesani, Diana Bellin, Antonella Furini, Sara Zenoni

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laboratorio [1° turno] 6 II semestre, I semestre Linda Avesani, Diana Bellin, Antonella Furini, Sara Zenoni

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laboratorio [2° turno] 6 II semestre, I semestre Linda Avesani, Diana Bellin, Antonella Furini, Sara Zenoni

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Obiettivi formativi

L’obiettivo del corso è di fornire agli studenti le conoscenze sulle tecnologie del DNA ricombinante e le metodologie applicate alle analisi genetiche molecolari e genomiche. Con le lezioni frontali si fornirà una panoramica delle metodologie genetiche tradizionali e di quelle più innovative per l’analisi dei geni e della loro funzione. A complemento della parte teorica si applicheranno nell’ambito delle varie lezioni di laboratorio le più comuni metodologie di genetica molecolare usate in organismi procarioti ed eucarioti. Al termine del corso lo studente conoscerà le principali tecniche di estrazione, analisi e manipolazione degli acidi nucleici e, espressione di proteine in sistemi eterologhi, le tecniche di trasformazione genetica di organismi vegetali e animali, i metodi di studio dell’espressione genica e quelli per lo studio delle interazioni proteina-proteina. I concetti acquisiti consentiranno allo studente di comprendere le parti sperimentali dei lavori scientifici in ambito genetico molecolare, e di applicare le tecnologie molecolari di base agli esperimenti di laboratorio.

Programma

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MM: teoria
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1) Il clonaggio: - Vettori plasmidici, marcatori di selezione e geni reporter (es: GFP); - Trasformazione di E. coli; - Selezione dei ricombinanti; - Metodi di clonaggio: (i) Vettori basati sull’utilizzo degli enzimi di restrizione; (ii) PCR e Clonaggio di un frammento di PCR tramite T/A cloning: Vettori pGEM; (iii) Clonaggio mediato da DNA topoisomerasi, il TOPO Cloning; (iv) Clonaggio per ricombinazione: i sistemi Gateway e Golden Gate Assembly 2) La trasformazione genetica in sistemi vegetali (pianta e protoplasti) e sistemi animali (Prof.ssa Furini). 3) Batteriofago λ, Cosmidi, BAC, YAC, librerie genomiche e cenni a librerie di cDNA, la trasformazione di lievito; 4) Estrazione del DNA genomico, estrazione di DNA plasmidico e da fagi; 5) Analisi di DNA e genomi mediante ibridazione (Southern blotting) e PCR, marcatori molecolari; 6) Sequenziamento classico Sanger, sequenziamento NGS e sequenziamento di terza generazione; cenni al sequenziamento di genomi e alla genomica; 7) Tecniche di mutagenesi random e sito specifica; 8) Genome editing e CRISPR/Cas9; 9) Genetica diretta e genetica inversa per comprendere la funzione dei geni, silenziamento genico (Prof. ssa Bellin). 10) Estrazione di RNA e analisi dell’espressione genica tramite Northern blotting, RT-PCR e Real Time RT-PCR; 11) Analisi di espressione su larga scala, piattaforme trascrittomiche basate su microarray ed RNA-Seq; 12) Geni reporter e loro utilizzo per studi funzionali e di espressione genica; 13) Studio dell’interazione DNA-proteina nella regolazione dell’espressione genica: Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP), Shift assay, saggio della luciferase (Prof.ssa Zenoni). 14) Targeting sub-cellulare per l’espressione di proteine ricombinanti in sistemi eterologhi (confronto sistemi procariotici ed eucariotici); 15) Descrizione degli strumenti per lo studio della localizzazione sub-cellulare di una proteina; 16) Elementi che influenzano la stabilità di una proteina e relativo studio; 17) Tecniche per la quantificazione di proteine presenti in soluzione (western blot, ELISA, saggi enzimatica (Prof. ssa Avesani).
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MM: laboratorio
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Durante la parte pratica del corso, agli studenti sarà proposto di implementare una strategia di subclonaggio di tipo TOPO-cloning, seguita dalla ricombinazione in vettore tipo Gateway. Il gene di interesse sarà amplificato tramite reazione di PCR e clonato in un vettore opportuno grazie all’attività della DNA isomerasi I. Dal costrutto ottenuto (entry vector), il gene di interesse sarà mobilitato tramite ricombinazione in due costrutti Gateway differenti (destination vectors), per l’espressione in lievito ed in pianta. Durante la procedura, i costrutti ricombinanti saranno amplificati tramite trasformazione di E. coli e successiva purificazione. I costrutti finali ottenuti saranno utilizzati per la trasformazione genetica di di piante di tabacco (Prof.ssa Furini) e lievito nelle successive esperienze. Analisi di DNA genomici: Estrazione del DNA genomico. Valutazione dell’efficienza di estrazione e qualità del DNA estratto mediante analisi spettrofotometrica e caricamento in gel di agarosio. Analisi con marcatori molecolari SSR per confrontare individui noti ed incogniti: preparazione degli ampliconi, analisi della taglia mediante sequenziatore ad elettroforesi capillare, scoring ed analisi dei risultati ottenuti. Esempi di analisi di parentela, identificazione varietale e posizionamento genomico utilizzando marcatori molecolari. Mutagenesi sito-specifica: pianificazione di mutagenesi sito specifica, disegno di primers per la mutagenesi, amplificazione e reazione di fosforilazione, ligazione e digestione con DpnI per l’arricchimento del plasmide mutagenizzato. Trasformazione di cellule competenti e recupero delle colonie trasformate. Screening dei plasmidi mutanti e verifica dell’espressione della proteina attiva o mutata (Prof. ssa Bellin). Analisi di espressione del transgene in un organismo transgenico mediante real-time RT-PCR: Estrazione dell’RNA dall’organismo transgenico e dal wt. Valutazione della qualità e quantità dell’RNA estratto, trattamento con DNAsi, retrotrascrizione e reazione real-time RT-PCR. Valutazione dei diversi livelli di espressione del transgene nel controllo e nell’organismo transgenico mediante calcolo del deltadeltaCt (Prof. ssa Zenoni). Estrazione proteine solubili totali da tessuto vegetale e da lievito e quantificazione del contenuto di proteine solubili totali. Valutazione del contenuto di proteina reporter (GFP) in sistemi vegetali e in lievito tramite test ELISA e tramite fluorimetria. (Prof. ssa Avesani)

Modalità d'esame

L’accertamento dell’apprendimento si effettua mediate prova scritta. La prova si compone di quesiti aperti e test a crocette sulla parte di teoria oltre ad esercizi relativi alla parte di laboratorio. Il voto finale sarà dato dalla media pesata in base ai CFU erogati da ciascun docente. Al punteggio finale contribuisce anche la valutazione delle relazioni di laboratorio. L'esame relativo alle parti dell'insegnamento erogate nel primo semestre è propedeutico all'esame relativo alle parti erogate nel secondo semestre.

Testi di riferimento
Attività Autore Titolo Casa editrice Anno ISBN Note
teoria Terry A. Brown Biotecnologie molecolari (Edizione 2) Zanichelli 2017 978-88-08-32096-4
laboratorio Terry A. Brown Biotecnologie molecolari (Edizione 2) Zanichelli 2017 978-88-08-32096-4
laboratorio Terry A. Brown Biotecnologie molecolari (Edizione 2) Zanichelli 2017 978-88-08-32096-4