Nuove frontiere nella biocatalisi (2019/2020)

Codice insegnamento
4S008292
Docente
Salvatore Fusco
Coordinatore
Salvatore Fusco
crediti
6
Settore disciplinare
BIO/10 - BIOCHIMICA
Lingua di erogazione
Italiano
Sede
VERONA
Periodo
II semestre dal 2-mar-2020 al 12-giu-2020.

Orario lezioni

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Obiettivi formativi

L'obiettivo principale del corso consiste nel fornire agli studenti conoscenze avanzate e di nuova frontiera nella biocatalisi e applicare tali competenze alla soluzione di problemi biotecnologici e alla progettazione e sintesi di nuove molecole.

Programma

1. Introduzione al corso e generalità sulla biocatalisi: Generalità sui concetti di biorisorse e ecosostenibilità; Principali caratteristiche degli enzimi; Cofattori e coenzimi; Nomenclatura e classificazione degli enzimi; Isoenzimi, sistemi e complessi multienzimatici.

2. Principi di termodinamica e cinetica delle reazioni chimiche: Bioenergetica e Termodinamica; Energia di attivazione e teoria dello stato di transizione; Cinetica delle reazioni chimiche; Velocità e ordine di reazione; Teoria degli urti e concetto di urto efficace (equazione di Arrhenius); Fattori che influenzano la velocità di reazione.

3. Principi di catalisi e cinetica enzimatica: Potere catalitico degli enzimi ed energia di legame; Esempi di catalisi enzimatica; Determinazione e significato della velocità iniziale (v0); L'equazione di Michaelis-Menten; Il significato dei parametri dell'equazione di M-M: Velocità iniziale (v0), velocità massima (Vmax), costante di M-M (Km), numero di turnover (kcat) e costante di specificità (kcat/Km); Reazioni enzimatiche a più substrati.

4. Meccanismi di reazione e regolazione dell’attività enzimatica: Meccanismo di reazione della chimotripsina e applicazione della cinetica dello stato pre-stazionario; Effetto del pH sull’attività enzimatica; Applicazioni dell’effetto del pH per lo studio dei meccanismi di reazione; Esempio di meccanismi di reazione (aspartil proteasi, esochinasi, enolasi, lisozima); Enzimi regolatori: allosteria, modifiche covalenti reversibili e proteolisi (zimogeni)

5. Linearizzazioni dell’equazione di M-M e inibizione enzimatica: Rappresentazioni lineari dell’equazione di M-M: Grafici di Lineweaver–Burk (dei doppi reciproci), Eadie–Hofstee e Hanes; Inibizione enzimatica (reversibile vs irreversibile); Agenti chimici che modifica gli enzimi irreversibilmente; Inibitori irreversibili: diretti al sito attivo (Affinity Labels), substrati suicidi (cavallo di troia) e Analoghi dello stato di transizione (Tight-Binding Inhibitors)

6. Effetto del pH e della temperatura sull’attività enzimatica: Dipendenza dal pH delle reazioni catalizzate dagli enzimi; Misurare l’attività enzimatica in funzione del pH; Effetto del pH sull’attività enzimatica in presenza di uno o due gruppi ionizzabili; Dipendenza delle costanti cinetiche in funzione del pH; Equazione di van’t Hoff e di Arrhenius; Come si misura la termofilia e la termostabilità degli enzimi; L’importanza della stabilità termica degli enzimi per le applicazioni industriali.

7. Aspetti pratici dello studio della cinetica enzimatica: Studio delle curve di progressione; Determinazione della velocità iniziale e delle unità enzimatiche; Limitazioni alla misurazione della velocità iniziale (dead time e stopped assays); Fattori che influenzano la determinazione dell’attività enzimatica (solventi, forza ionica, pH e temperatura); Stabilità degli enzimi e metodi di conservazione.

8. Metodi per misurare dell’attività enzimatica e saggi enzimatici: Spettroscopia UV/visibile; Spettrofluorimetria; Luminescenza; Radioattività; Saggi enzimatici diretti e indiretti; Saggi enzimatici accoppiati; Saggi enzimatici applicatici in diagnostica clinica; Saggi immunoenzimatici; Saggi enzimatici continui e discontinui.

9. Ingegneria proteica e reazioni enzimatiche in mezzi non convenzionali: Ingegneria proteica (principi e definizioni); Modifiche chimiche; Modifiche genetiche: Rational design versus Directed evolution; Caratteristiche dei metodi di screening;
-Tecniche di rational design: PCR con MegaPrimer, Whole plasmid PCR, Mutagenesi a cassetta, il metodo di Kunkel, il metodo di mutagenesi sito-diretta QuikChange;
- Tecniche di directed evolution: Error-Prone PCR, MEGAWHOP, Gene Assembly Mutagenesis, Ceppi mutageni, mutagenesi mediata da oligonucleotidi random, DNA Shuffling, ricombinazione del DNA mediante random priming, Staggered Extension Process, metodi di ricombinazione in vitro (RACHITT, ITCHY, SCRATCHY, SHIPREC);
-Techiche di semi-rational design: Structure-based combinatorial protein engineering (SCOPE) e SCHEMA structure-guided recombination;
- Enzimi in mezzi non convenzionali (medium engineering); reazioni enzimatiche in solventi organici; sistemi bifasici, co-solventi e solventi organici puri; altri mezzi non convenzionali (liquidi ionici, fluidi supercritici e miscele eutettiche).

10. Catalisi enzimatica omogenea ed eterogena (immobilizzazione): Aree di applicazione della catalisi omogenea; Sistemi multienzimatici (cascate enzimatiche lineari, parallele, ortogonali e cicliche); Esempi pratici di cascate enzimatiche (produzione di composti chimici profumati, amminoacidi non naturali, precursori plastici, pirrolidina di-sostituite, derivati della D-fenilalanina); Catalisi eterogena (immobilizzazione degli enzimi); Vantaggi e svantaggi dell’immobilizzazione; Supporti per l’immobilizzazione; Strategie d’immobilizzazione (covalente, adsorbimento, intrappolamento e incapsulamento); Immobilizzazione senza supporto (CLECs and CLEAs); Nuove frontiere dell’immobilizzazione enzimatica: supporti virali e nanoreattori.

11. Biocatalisi applicata alle plastiche: Proprietà chimico-fisiche che influenzano la degradabilità delle plastiche; Enzimi che idrolizzano polimeri plastici (PET hydrolytic enzymes (PHEs)); Ingegneria proteinica per l’ottimizzare dei PHEs; Ideonella sakaiensis quale modello di batterio che metabolizza la plastica PET; Enzimi specifici per l’idrolisi del PET (PETasi); Produzione di acido lattico da biomasse lignocellulosiche come precursore di bioplastiche; utilizzo di batteri lattici per la produzione di bioplastica; Strategia di pre-adattamento per ottimizzare la produzione di acido lattico.

12. Il sistema CRISPR-Cas principi e applicazioni: CRISPR locus e geni cas; Meccanismo di funzionamento del sistema CRISPR-Cas; I tre tipi principali di sistemi CRISPR/Cas; Approfondimenti sul sistema CRISPR/Cas9; Applicazione del sistema CRISPR/Cas9 per il genome editing e l’ingegneria proteica; Varianti dell’endonucleasi Cas9 e loro applicazioni; il sistema CRISPR/Cas9 come strumento di screening di library di mutanti generate mediante directed evolution.

13. Citocromi P450, una famiglia di catalizzatori promiscui: Caratteristiche dei citocromi P450; L’importanza della promiscuità catalitica per l’evoluzione di nuovi enzimi; Tipi di reazioni catalizzare dai citocromi P450; Vantaggi e svantaggi dell’utilizzo dei citocromi P450; Principali classi di citocromi P450; Il ciclo catalitico dei citocromi P450; Reazioni di disaccoppiamento; Ingegnerizzazione del citocromo P450BM3 per l’idrossilazione di alcani; Sviluppo di reattività non naturale per la ciclo-propanazione di alcheni; L’importanza del ligando assiale nei citocromi P450 per lo sviluppo di reattività non naturali.

Durante il corso il docente fornirà materiale didattico (capitoli di libri, articoli scientifici e diapositive) che sarà reso disponibile attraverso la piattaforma Moodle.

Gli argomenti riportati sono solo indicativi dei contenuti didattici del corso e possono essere soggetti a modifiche da parte del docente.

Testi di riferimento
Autore Titolo Casa editrice Anno ISBN Note
Hans Bisswanger Practical Enzymology Wiley-Blackwell 2011

Modalità d'esame

L'esame finale mira a verificare il raggiungimento degli "Obiettivi formativi" relativi agli argomenti riportati nel "Programma dell’insegnamento".
La modalità di verifica dell’apprendimento prevede una prova orale volta ad accertare sia l’acquisizione delle conoscenze definite nel programma d'insegnamento sia la capacità di eseguire i necessari collegamenti logico-deduttivi. In particolare, il grado di completezza della risposta, il livello di integrazione tra i vari contenuti del corso e l'appropriatezza scientifica del linguaggio saranno tutti elementi oggetto di valutazione.
Inoltre, il raggiungimento da parte del/della candidato/a di una visione organica dei temi affrontati a lezione, congiunta alla loro utilizzazione critica, la capacità di fare collegamenti, la dimostrazione del possesso di una padronanza espositiva e di linguaggio specifico saranno valutati con voti di eccellenza.
La modalità d'esame è la stessa sia per i candidati frequentanti sia non frequentanti.