Tecnologie biomolecolari - Teoria (modulo 2) (2007/2008)

Obiettivi formativi

Il corso intende trattare alcune tecniche di largo utilizzo per l’analisi molecolare dei geni.

>IBRIDAZIONE TRA ACIDI NUCLEICI

1.INTRODUZIONE ALL’IBRIDAZIONE TRA ACIDI NUCLEICI: FORZE CHE STABILIZZANO IL DNA, EFFETTI DEL pH E DELLA TEMPERATURA, TEMPERATURA DI MELTING (Tm), FATTORI CHE INFLUENZANO LA Tm
2.TIPI DI IBRIDAZIONE
3.IBRIDAZIONE IN SOLUZIONE: RIASSOCIAZIONE DEL DNA, PARAMETRI CHE INFLUENZANO LA RIASSOCIAZIONE/IBRIDAZIONE (FATTORI CHE INFLUENZANO LA VELOCITÀ DI FORMAZIONE DEGLI IBRIDI, FATTORI CHE INFLUENZANO LA STABILITÀ DEGLI IBRIDI)
4.IBRIDAZIONE SU FILTRO: TIPOLOGIE DI SUPPORTI E PROPRIETÀ, TRASFERIMENTO DI ACIDI NUCLEICI SU FILTRO, IMMOBILIZZAZIONE DEGLI ACIDI NUCLEICI SU FILTRO, SCREENING LIBRERIE RICOMBINANTI, DOT E SLOT BLOT, REVERSE DOT BLOT, SOUTHERN BLOT, NORTHERN BLOT (ESTRAZIONE DELL’RNA E GEL DENATURANTI)
5.SCELTA DELLA SONDA: DNA O RNA? SONDA RADIOATTIVA E NON RADIOATTIVA, MARCATURA DIRETTA E INDIRETTA, MARCATURA IN TUTTA LUNGHEZZA (NICK-TRANSLATION, RANDOM PRIMED LABELING, PCR-MEDIATED LABELING, RUN-OFF TRANSCRIPTION, METODI CHIMICI), MARCATURA TERMINALE AL 5’ E AL 3’ (T4 POLYNUCLEOTIDE KINASE, FILL-IN MEDIANTE KLENOW, DNA TAILING MEDIANTE TERMINAL DEOXYNUCLEOTIDYL TRANSFERASE), DETECTION DEGLI IBRIDI RADIOATTIVI (AUTORADIOGRAFIA), DETECTION DEGLI IBRIDI NON RADIOATTIVI (FOSFATASI ALCALINA, PEROSSIDASI, SUBSTRATI ENZIMATICI COLORIMETRIA E CHEMIOLUMINESCENZA)
6.ALCUNE APPLICAZIONI SPECIFICHE DELL’IBRIDAZIONE SU FILTRO: DNA MAPPING, DETECTION DI SEQUENZE OMOLOGHE, DNA FINGERPRINTING, DETECTION DI MUTAZIONI, DETECTION DI METILAZIONI.

>PCR

1.DEFINIZIONE
2.MISCELA DI REAZIONE: EFFICIENZA, SPECIFICITA’, FEDELTA’
3.CICLO DI PCR. NUMERO FINALE DI MOLECOLE TARGET
4.AMPLIFICAZIONE DEL PRODOTTO CORRETTO: VISUALIZZAZIONE E ANALISI DEI PRODOTTI DI PCR, COME EVITARE LE CONTAMINAZIONI (URACIL N-GLYCOSYLASE; UV; TRATTAMENTO ENZIMATICO), HOT START, NESTED PCR
5.TECNICHE E APPLICAZIONI: 5’RACE-PCR E 3’RACE-PCR, RT-PCR, PCR MUTAGENESI (DELEZIONE DI SEQUENZE, SOSTITUZIONE DI BASI, INSERZIONE DI SEQUENZE), MODIFICAZIONE DI PRODOTTI DI PCR (AGGIUNTA DI PROMOTORI, RIBOSOME-BINDING SITE, SITI DI RESTRIZIONE), UNIONE DI PRODOTTI DI PCR SOVRAPPOSTI “OVERLAPPING”, PCR QUANTITATIVA

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