Biomolecular Technology - 2° modulo (2004/2005)

Learning outcomes

Obiettivo del corso (modulo II) è, in generale, di fornire i principi su cui si basano le tecniche di analisi degli acidi nucleici (DNA e RNA). A tal fine, la parte pratica del laboratorio consiste nell’analisi per Southern blot dello stato transgenico e del numero di copie del transgene integrate nel genoma. L’analisi dell’espressione genica è eseguita per RT-PCR su RNA totale e viene paragonata ad altre metodiche di analisi (northern blot, RT-qPCR).

Teoria: Analisi di acidi nucleici per ibridazione. Southern and northern BLOT. Northern e “reverse northern”
Sonde: Tipi e metodi di preparazione (“marcatura”).
Pratica: Analisi per Southern blot dello stato transgenico di piante di pomodoro
1. ESTRAZIONE DNA GENOMICO
2. QUANTIFICAZIONE E RESTRIZIONE
3. Separazione su GEL di AGAROSIO
4. ASSEMBLAGGIO del sistema di trasferimento (CAPILLARITA’)
5. MARCATURA della sonda per incorporazione di dUTP modificati con fluoresceina
6. IBRIDAZIONE filtro/sonda E LAVAGGI DI STRINGENZA
7. DETECTION CON ANTICORPO

Teoria: RT-PCR ed analisi dell’RNA messaggero
1. ESTRAZIONE e purificazione di RNA polyA (colonne, beads+ polyT)
2. REAL TIME QUANTITATIVA, CONFRONTO CON PCR TRADIZIONALE
3. GEL DI POLYACRILAMIDE

Pratica: RT-PCR
1. ESTRAZIONE RNA TOTALE CON TRIZOL
2. QUANTIFICAZIONE E TRATTAMENTO CON DNAse (RNAse-free)
3. Trascrizione inversa con primer OLIGO-dT
4. PCR CON PRIMERS SPECIFICI
5. Analisi amplicone

Elaborato scritto e discussione orale dell’esercitazione di laboratorio.