Tecnologie biomolecolari - 1° modulo (2004/2005)

Obiettivi formativi

Scopo del corso è quello di contribuire a formare una figura professionale che abbia un’appropriata conoscenza delle metodiche molecolari e che possieda la capacità di applicarle in situazioni concrete. Lo studente è chiamato ad un’impegno teorico e pratico. L’obiettivo formativo primario è quindi rappresentato dall’apprendimento delle metodologie necessarie allo svolgimento delle più comuni pratiche di manipolazione del DNA che un biotecnologo sarà chiamato a svolgere. In particolare il corso tratta le principali tecniche di purificazione degli acidi nucleici, la loro separazione mediante elettroforesi, la manipolazione del DNA e le metodologie per clonaggio in vettori batterici, virali e di lievito.

1- Concetti e tecniche di purificazione degli acidi nucleici
Purificazione del DNA
Preparazione DNA plasmidico
Preparazione DNA genomico
Preparazione DNA fagico
Purificazione dell’RNA
Preparazione RNA totale
Purificazione mRNA

3- Separazione degli acidi nucleici mediante elettroforesi
Gel di agarosio
Per DNA
Per RNA
Elettroforesi pulsata
Gel di acrilammide
Per DNA
Per Proteine

4- Manipolazione del DNA e clonaggio
Caratteristiche e strategie d’uso dei vettori di clonaggio
Plasmidi
Cosmidi
Batteriofagi
Cromosomi artificiali di lievito (YAC)
Cromosomi artificiali batterici (BAC)
Clonaggio in E. coli
Digestione con enzimi di restrizione
Recupero frammenti DNA da gel di agarosio
Defosforilazione vettore
Ligatura
Preparazione cellule competenti
Trasformazione
Costruzione librerie fagiche
Preparazione frammenti DNA/cDNA
Ligatura
Packaging
Titolazione della libreria
Analisi cloni/placche ricombinanti

Valutazione del grado di preparazione mediante colloquio