L’acquisizione di nitrato e ammonio dal suolo è uno degli aspetti chiave della nutrizione azotata; l’efficienza di tale processo può essere condizionata sia dalle disponibilità delle forme di N alla rizosfera che dalla modalità con cui i flussi di nitrato e ammonio, nelle e dalle radici, sono regolati. Su queste basi, allo scopo di ottenere informazioni su possibili determinanti l’efficienza nutrizionale, con il presente progetto verranno analizzate: 1) la dinamica di rilascio e composizione quali-quantitativa degli essudati radicali, 2) gli aspetti cinetici e di regolazione dei flussi di N nelle e dalle radici, 3) l’espressione genica nelle diverse condizioni nutrizionali (fluttuazioni nella disponibilità di nitrato e/o ammonio). Le analisi verranno svolte utilizzando le linee pure di mais Lo5 e T 250 caratterizzate da diversa efficienza per la nutrizione azotata.
1) Dinamica di rilascio e composizione quali-quantitativa degli essudati radicali.
La composizione delle rizodeposizioni può variare non solo da specie a specie ma anche all’interno di un singolo apparato radicale e in funzione delle disponibilità nutrizionali. Per questi aspetti un ruolo particolarmente significativo è svolto da nitrato e ammonio, l’assunzione dei quali determina una diversa attività metabolica di assimilazione in grado di modificare tipi e quantità di rizodeposizioni rilasciate. Ciò può indurre condizioni differenziate per quanto riguarda l’attività e la composizione della popolazione microbica in grado di influenzare il ciclo interno dell'N e determinare livelli diversi di disponibilità del nutriente. Piantine di mais verranno quindi allevate in soluzione idroponica modulando (mediante aggiunta di nitrato o rimozione di ammonio al/dal mezzo di crescita, vedi paragrafo successivo) le velocità di assorbimento delle due forme azotate. Da questo materiale vegetale saranno raccolti, purificati e analizzati gli essudati radicali valutandone la composizione e la dinamica di rilascio nel tempo.
2) Aspetti cinetici e di regolazione dei flussi di N nelle e dalle radici
Verranno utilizzate plantule di mais delle due linee allevate in soluzione idroponica simulando le modificazioni di disponibilità nutrizionale che si verificano in campo in seguito alle fluttuazioni che subisce il nutriente per cause naturali (es. lisciviazione, nitrificazione e denitrificazione) o antropiche (es. concimazioni). Dopo un certo periodo di allevamento a concentrazione di N costante, la concentrazione del nutriente verrà variata (aumentata per il nitrato e diminuita per l’ammonio) determinando l’induzione o la derepressione (per nitrato e ammonio rispettivamente) dei sistemi di trasporto e di conseguenza la modulazione della velocità di assorbimento dei due nutrienti. Attraverso l’uso di 15NO3- o 15NH4+ (rivelazione mediante analizzatore elementale CHN accoppiato ad uno spettrometro di massa a discriminazione isotopica 15N/14N) nelle diverse fasi di modulazione della velocità di assorbimento, verranno determinate le velocità di influsso dei due ioni e sarà verificata l’influenza della presenza di ammonio sulla velocità di assorbimento del nitrato. L’uso di 15N e la contemporanea determinazione spettrofotometrica dei flussi netti permetterà di valutare anche la componente di efflusso di nitrato e composti azotati. Verranno anche condotti esperimenti utilizzando rizobox. Le piante allevate nei rizobox in un suolo a basso contenuto di N verranno trattate (concimazione) con NH4NO3 marcato (15N) sull’ammonio o sul nitrato. Verranno valutati, per le due linee, l’accumulo di 15N in radici e foglie e la distribuzione dell’N nel suolo rizosferico (suolo che aderisce alla superficie delle radici con l’aggiunta di quello circostante le radici stesse fino a una distanza non superiore ai 2-3 mm) e non rizosferico.
3) Analisi dell’espressione genica nelle diverse condizioni nutrizionali.
Sulle due linee verrà anche condotto il lavoro di identificazione e analisi funzionale dei geni coinvolti nel processo di assorbimento e assimilazione delle forme azotate; questo approccio si avvarrà della tecnologia della piattaforma Combimatrix presente presso il Centro di Genomica funzionale vegetale dell’Università degli Studi di Verona. Si stima di poter allestire un chip con almeno 25.000 geni che una volta ibridizzati con RNA estratto da tessuti di radici e foglie delle piante trattate nelle diverse condizioni saranno analizzati mediante opportuni programmi di “clusterizzazione”. Ciò consentirà di individuare i geni indotti o repressi durante i trattamenti e sarà così possibile definire a livello molecolare i percorsi metabolici coinvolti nei vari regimi nutrizionali.
