Le emoglobine (Hb) sono presenti in una grande varieta’ di organismi, dai batteri agli eucarioti unicellulari, alle piante e animali. Le Hb da piante superiori sono state classificate in simbiotiche e non simbiotiche .Le prime si ritrovano in piante capaci di partecipare ad associazione simbiotica con microorganismi della rizosfera nelle quali la loro funzione e’ quella di regolare l’apporto di ossigeno ai batteri fissatori di azoto. Le Hb non simbiotiche (nsHb), scoperte piu’ recentemente, si ritiene precedano nell’evoluzione le piu’ specializzate leghemoglobine simbiotiche: la loro natura ubiquitaria e la loro lunga storia evolutiva suggeriscono un ruolo importante delle nsHb per la vita delle piante. Si conosce molto poco della loro funzione, sebbene sia stato proposto un loro coinvolgimento in piu’ di un percorso metabolico. Le nsHb sono inusuali in quanto il loro gruppo prostetico e’ esacoordinato sia nello stato Fe(II) che Fe(III). L’esacoordinazione risulta da due residui di His che legano il Fe dell’eme al quinto e sesto sito di coordinazione, quest’ultimo tradizionalmente occupato da O2 ed altri ligandi. A dispetto della potenziale inibizione del legame , le nsHb legano O2 ed altri ligandi con affinita’ molto elevate. Per questa ragione e’ stato suggerito che esse non abbiano la funzione di proteine di trasporto o di deposito dell’O2, ma siano coinvolte in reazioni metaboliche in condizioni di bassa tensione di ossigeno.
Arabidopsis possiede due nsHb: AHb1 e AHb2. Le loro caratteristiche suggeriscono che esse differiscono per funzione sia tra di loro che rispetto alle Hb simbiotiche. AHb1 e’ fortemente indotta in condizioni di ipossia , il che suggerisce che sia una proteina correlata allo stress. A pH fisiologico, la sua affinita’ per l’O2 e’ cosi elevata (Kd 1.6 nM) da rendere improbabile che la sua funzione sia quella di trasportare O2. AHb2 e’ espressa a bassi livelli nelle foglie ed e’ inducibile da basse temperature ; presenta una piu’ bassa affinita’ per l’O2 rispetto ad AHb1, ma come quest’ultima possiede una costante di dissociazione per l’O2 molto bassa .AHb1 possiede sequenza e costanti di legame per l’O2 caratteristiche delle Hb indotte da stress, mentre AHb2 ha una maggiore similitudine con le Hb simbiotiche, sia in sequenza che nelle proprieta’ di legame per l’O2 .
In un recente studio abbiamo ottenuto evidenze che suggeriscono che Ahb1 funziona come NO diossigenasi e metabolizza NO a nitrato utilizzando NADPH come donatore di elettroni (unpublished). Abbiamo anche evidenziato che in pianta si produce Ahb1 S-nitrosilata, suggerendo che residui di cys possano avere un ruolo conservato nel metabolismo di NO e S-nitrosotioli. In vivo AHb1 riduce l'emissione di NO in condizioni di stress ipossico , confermando il suo ruolo nella detossificazione di tale composto. La cinetica della reazione di detossificazione dell'NO e' lenta, e quindi non interferisce nella massiccia produzione di NO che ha luogo nella risposta acuta, come ad esempio nella risposta di ipersensibilita' all'attacco dei patogeni.
L'obiettivo del presente progetto e' duplice. In primo luogo condurre uno studio approfondito sull'attivita' NO diossigenasica NADPH dipendente di Ahb1 e determinare se nelle cellule vegetali sia presente una specifica metAHb1 reduttasi a sostenere ciclicamente tale attivita' enzimatica, come ipotizzato .
In secondo luogo ci si propone di mutare selettivamente specifici residui in Ahb1 ed Ahb2 allo scopo di delucidare le basi molecolari della loro elevata affinita' per l'O2 e ottenere informazioni sulle caratteristiche strutturali della tasca di legame dell'eme, con l'obiettivo di correlare queste informazioni alla possibile funzione biologica di tali proteine.
Espressione e purificazione di Ahb1 e Ahb2 per studi strutturali: Ahb1 ed Ahb2 saranno espresse in E.coli, ceppo BL21. Ahb1 sara' purificata mediante cromatografia ad interazione idrofobica e a scambio anionico. Ahb2 sara' purificata da precipitazione frazionata con ammonio solfato e un singolo passaggio di cromatografia ad interazione idrofobica.
Identificazione di una specifica metAHb1 -reduttasi in estratti cellulari di piante sovraesprimenti Ahb1 Abbiamo recentemente dimostrato che AHb1 da Arabidopsis metabolizza NO e GSNO a nitrato (unpublished data). Il GSNO rappresenta una importante forma di trasporto di NO nei sistemi biologici. La reazione di AHb1 con GSNO risulta nella S-nitrosilazione della proteina. AHb1 S-nitrosilata si produce anche in pianta, indicando che anche la rimozione di NO in vivo da parte di AHb1, passa attraverso la formazione di S-nitrosoHb. Sotto questo aspetto AHB1 sembra operare come l’Hb di Ascaris , che ha evoluto un meccanismo cys-dipendente per detossificare NO/O2 . Sia in AHb1 che nell’Hb di Ascaris mancano i residui di Cys prossimali implicati in funzioni NO-correlate nell’Hb umana . Tuttavia, AHb1 possiede due residui di cys, E15 ed E16, nel sito distale dell’eme, una delle quali e’ omologa alla cys distale E15 di Ascaris. Similmente alla Hb di Ascaris, dunque, AHb1 sembra conservare la funzione di detossificazione di NO/SNO posizionando residui di cys nel sito distale, mentre la funzione di trasporto dell’NoO da parte dell’Hb umana si realizza mediante l’uso di tioli prossimali. La nostra ipotesi e’ che residui di cys distali rappresentino una caratteristica specifica dell’attivita’ dell’Hb nel meccanismo di detossificazione di NO/SNO. Allo scopo di verificare tale ipotesi, abbiamo in programma di mutare CysE16Ala in AHb1 e di studiare la proteina mutata rispetto all’interazione con GSNO.
