Progettazione e validazione di DNA array per il rilevamento di geni di antibiotico resistenza in batteri di interesse alimentare

Starting date
September 1, 2004
Duration (months)
12
Departments
Biotechnology
Managers or local contacts
Torriani Sandra

Negli ultimi decenni, l’ampio utilizzo degli antibiotici ha portato alla comparsa e alla diffusione di microrganismi resistenti verso una o più sostanze antibatteriche. Tale fenomeno costituisce una grave minaccia per la salute umana, in quanto le antibiotico resistenze (AR) vengono rilevate sempre più spesso anche in batteri normalmente associati a prodotti alimentari di largo consumo. Il problema della diffusione di AR è aggravato dal fatto che i loro determinanti genici possono essere trasmessi a batteri patogeni o potenzialmente tali che potrebbero essere difficilmente controllabili con i tradizionali farmaci antibatterici. Infatti, i geni di AR sono spesso localizzati su elementi genetici mobili, quali plasmidi e trasposoni, e tramite essi possono essere trasmessi da un microrganismo all’altro, a livello intra-, inter-specifico e inter-generico.
I batteri AR isolati dagli alimenti possono portare resistenze potenzialmente trasmissibili verso ciascuno degli antibiotici tra quelli più frequentemente utilizzati per uso clinico o auxinico. Queste sostanze antibatteriche appartengono a diverse classi, che si differenziano per struttura e modalità d’azione. Nel corso dell’applicazione su vasta scala degli antibiotici si sono evoluti diversi meccanismi biochimici di resistenza verso un particolare antibatterico, tra cui: i) inattivazione dell’antibiotico, ii) alterazione della struttura bersaglio, iii) espressione di un target alternativo, iv) modificazione della permeabilità. Molti di questi meccanismi sono determinati dall’attività di specifici geni, le cui sequenze sono state ottenute per diversi tipi di batteri. Più meccanismi possono essere contemporaneamente coinvolti nella resistenza ad un antibiotico e, allo stesso tempo, esistono differenti geni codificanti per proteine con lo stesso sistema di azione. A titolo di esempio, si può considerare la resistenza alle tetracicline, che è dovuta principalmente alla presenza di proteine di protezione dei ribosomi (RPPs) o di pompe di efflusso. Diverse classi di geni sono coinvolti nel meccanismo di protezione dei ribosomi (ad esempio tetM, tetO, tetB/P, tetQ, tetS, otrA). I determinanti genici dei sistemi di efflusso sono risultati differenti tra batteri Gram-negativi (tetA, tetB, tetC, tetD, tetE, tetG, tetH) e Gram-positivi (tetK, tetL). Un terzo meccanismo di resistenza alla tetraciclina si basa sull’inattivazione enzimatica dell’antibiotico ed è legato alla presenza di geni specifici (es. tetX). Gran parte di questi geni sono stati sequenziati e caratterizzati, ed è stato evidenziato un elevato livello di omologia di sequenza tra i geni di diversi generi e specie batteriche. Analogamente alle tetracicline, anche la resistenza verso altri antibiotici può essere codificata da numerose classi di geni: ad esempio diverse classi codificano per beta-lattamasi (HMS1, CARB1, TEM1-6, SHV, OXA1-7, PSE1-4), numerosi geni determinano la resistenza ai macrolidi (ribosoma-metilasi: geni erm; proteine di efflusso: geni vat, msr, vga, mef; enzimi antibiotico-inattivanti: geni vgb, lin, vat, sat, mph), i geni aph, aac e ant codificano per la detossificazione degli aminoglicosidi. Attualmente sono noti più di 100 geni che codificano per AR trasmissibili.
La crescente diffusione di microrganismi AR e l’individuazione di sempre nuovi geni responsabili dell’AR rende difficile e complessa l’applicazione di adeguate strategie di controllo per scopi epidemiologici e per la valutazione dell’entità del rischio legato alla loro presenza ed eventuale trasmissione negli alimenti. Attualmente i geni che codificano per AR sono rilevati tramite reazioni di amplificazione (PCR). In letteratura sono descritti numerosi protocolli di PCR per rilevare in modo specifico molti geni trovati nelle specie batteriche associate ad alimenti o isolate da campioni nosocomiali. Di conseguenza, il numero di analisi necessarie per individuare i determinanti genici nei batteri AR che possono contaminare gli alimenti risulta essere molto elevato ed, inoltre, il risultato delle reazioni di PCR non fornisce ulteriori informazioni se non quello relativo alla presenza o assenza del singolo gene ricercato.
Negli ultimi anni, è stato sviluppato un innovativo approccio metodologico, l’analisi con DNA microarray, che apre nuove interessanti potenzialità di indagine in quanto consente di ricercare contemporaneamente un elevato numero di geni, fornire informazioni molecolari sulle sequenze e di ottenere risultati in tempi rapidi superando gli svantaggi dei metodi tradizionali.
La ricerca di sequenze di AR mediante DNA microarray ha finora riguardato un numero esiguo di geni: il gene mecA, responsabile per la meticillina resistenza di stafilococchi e la resistenza alla ciprofloxacina acquisita da Neisseria gonorrhoeae in seguito a mutazioni puntiformi. Pertanto lo sviluppo di un array con sonde per i più importanti geni di resistenza noti rappresenterebbe uno strumento di impareggiabile validità per la rapida valutazione della diffusione e del rischio di espansione delle antibiotico resistenze negli alimenti.
Obiettivo del progetto è la progettazione, realizzazione e verifica applicativa di uno o più DNA array contenenti come “capture probes” sequenze specifiche per i principali marker genetici di antibiotico resistenza (AR) finora noti.
Tali piattaforme verranno utilizzate per valutare la diffusione di geni responsabili di resistenze trasmissibili agli antibiotici di uso clinico e auxinico in batteri presenti negli alimenti fermentati, quali formaggi ed insaccati. I DNA array creati saranno applicabili per l’analisi di acidi nucleici estratti da isolati batterici con AR e da campioni alimentari di diversa origine.
I sistemi miniaturizzati progettati nella presente proposta potranno, nell’immediato, essere utilizzati per una caratterizzazione completa del profilo di geni codificanti le AR dei ceppi isolati e per la valutazione della “safety” di campioni di alimenti. A lungo termine potranno servire come strumenti adatti a velocizzare notevolmente studi sul collegamento tra contenuto di batteri AR negli alimenti ed epidemiologia di episodi infettivi causati da batteri AR, anche ai fini di una realistica valutazione del rischio.

Sponsors:

Ateneo
Funds: assigned and managed by the department
Syllabus: RICATENEO - Finanziamenti d'Ateneo per la Ricerca Scientifica

Project participants

Desj Simeoni
Sandra Torriani
Full Professor
Research areas involved in the project
Biotechnology & Applied Microbiology

Activities

Research facilities