Caratterizzazione mediante NMR e Simulazioni di dinamica molecolare di proteine appartenenti alla superfamiglia delle calicine

Data inizio
1 gennaio 2003
Durata (mesi) 
12
Dipartimenti
Biotecnologie
Responsabili (o referenti locali)
Molinari Henriette

Il presente progetto è la continuazione del precedente progetto sulla caratterizzazione struttura-funzione di proteine che legano piccole molecole idrofobiche. Il progetto sarà articolato nei seguenti punti:
1) Espressione, Purificazione e Mutagenesi sito-diretta
Abbiamo iniziato la produzione di beta-lattoglobulina bovina e porcina ricombinante (BLG, PLG) e abbiamo sostanzialmente completato l'espressione di LbFABP da fegato di pollo.
Nella prima fase del progetto, gli studi NMR di seguito riportati, verranno condotti sulla LbFABP ricombinante mentre nella seconda fase tali studi saranno estesi alle beta-lactoglobuline ricombinanti, non appena pronte.
2) Caratterizzazione strutturale
a) PLG. Esperimenti eteronucleari 2D e 3D saranno condotti sulla proteina arricchita per ottenere l'assegnazione NMR completa (1H,13C e 15N). L'informazione sulle distanze interprotoniche, gli angoli torsionali, e i legami idrogeno (identificati tramite misure di scambio idrogeno/deuterio a varie temperature) saranno usati come input per le simulazioni di dinamica molecolare (DYANA) per ottenere famiglie strutturali.
b) LbFABP. Stiamo completando la determinazione strutturale, via NMR e dinamica molecolare vincolata (RMD) della LbFABP purificata da fegato di pollo dall'unità di Verona1. L'assegnazione protonica della proteina apo è stata ottenuta a pH 5.6, 310K e a 500 MHz, attraverso esperimenti 2D NMR standard. L'analisi degli NOE ha indicato la presenza di una struttura a barile beta, costituita da 10 strand beta e due eliche nella regione N-terminale della proteina. La disponibilità di campioni arricchiti in 15N, permetterà un'analisi accurata della struttura. Verrà inoltre caratterizzata strutturalmente la proteina olo, complessata con acido palmitico (PA). La localizzazione di PA all'interno della proteina sarà completata con l'analisi degli NOE intermolecolari.
3) Studi di folding
Studi di folding, condotti su BLG, PLG e LbFABP, permetteranno di analizzare in modo più generale, il folding delle proteine-beta. I nostri studi di folding su LbFABP di pollo permetteranno di chiarire se i due gruppi di proteine, FABP, e FABP di tipo basico, che mostrano una bassa similarità (>40%) ma lo stesso fold, condividano uno stesso meccanismo di folding.
La denaturazione di LbFABP di pollo verrà seguita, a livello del singolo residuo, eseguendo una serie di esperimenti 2D 1H-15N HSQC tra 0 e 7M di urea, in condizioni di equilibrio. Le velocità per lo scambio idrogeno/deuterio (H/D) saranno inoltre misurate in funzione della quantità di denaturante. Questi dati permetteranno di ottenere i principali parametri termodinamici, e di identificare il meccanismo di folding. Inoltre misure di rilassamento (15N T1, T2 e 1H-15N NOE) saranno condotte ad appropriate molarità di urea, a due diversi campi magnetici, per ottenere i parametri di mobilità e indicazioni sulla struttura residua . Sarà dedicata molta attenzione allo studio delle strutture residue intorno ai cluster idrofobici in presenza di alte concentrazioni di urea. Un criterio utile per verificare quali residui siano coinvolti nella formazione di un cluster idrofobico in una proteina denaturata è lo studio dell'andamento della velocità di rilassamento trasversale R2 dei gruppi amidici di backbone, misurata tramite esperimenti 1H-15N. Il valore di R2 atteso per catene "random coil" può essere dedotto dall'andamento sostanzialmente costante di R2 in funzione del numero del residuo. Residui che formano cluster idrofobici mostrano invece valori elevati di R2, facilmente evidenziabili.
4) Studi di solvatazione ed interazione
Tali studi sono volti alla chiarificazione del ruolo dell'acqua nella modulazione e nella specificità dell' interazione e verranno condotti attraverso esperimenti 1H-15N sulla LbFABP di pollo apo e olo. Le interazioni acqua-proteina possono essere studiate attraverso l'analisi dei rapporti delle velocità di cross-rilassamento in esperimenti NOESY e ROESY, ottenendo così informazioni sulle acque con tempi di residenza maggiori di 1 ns. Abbiamo recentemente dimostrato, utilizzando proteine modello, che l'analisi congiunta di effetti Overhauser acqua-proteina e dei profili di attenuazione paramagnetica indotta da nitrossidi solubili, può essere utilizzata per identificare i siti superficiali dove si localizzano cluster di acqua ordinata . Questo approccio, che utilizza una serie di esperimenti 2D ePHOGSY, sarà applicato alla LbFABP di pollo apo ed olo per identificare i diversi tipi di interazione acqua-proteina che saranno ulteriormente studiate tramite simulazioni MD a tempi lunghi con solvente esplicito per evidenziare i moti della acque su diverse scale di tempi.
La spettroscopia NMR è sensibile ai moti in un ampio intervallo di tempo e quindi permette di ottenere informazioni sulla dinamica del sistema in esame. L'analisi dei parametri di rilassamento eteronucleari (1H-15N NOE, N15 T1 e T2) forniranno informazioni sui moti di backbone del vettore NH per le proteine nelle forme apo e olo, mentre la dinamica delle catene laterali sarà ottenuta dall'analisi dei parametri di rilassamento 13C.
5) Simulazioni
Lunghe simulazioni di dinamica molecolare verranno condotte con il metodo MM/PBSA. In una prima fase del progetto raffineremo i parametri e la metodologia. In particolare faremo simulazioni su piccoli sistemi quali oligopeptidi con note propensità strutturali. L'energia libera MM/PBSA delle diverse conformazioni sarà utilizzata per ottimizzare la costante dielettrica per il protocollo e possibilmente per aggiungere piccoli termini ad hoc per mantenere le caratteristiche tipiche del peptide. Implementeremo il protocollo usando, per le simulazioni MD, GROMACS, che sembra essere più veloce di CHARMM attualmente in uso, anche se alcune caratteristiche necessiteranno delle modifiche. Dinamiche molecolari di 1 o 2 ns saranno condotte per le tre proteine native sia con il nostro protocollo che con solvente esplicito, seguendo i moti del backbone, per valutare l'accuratezza del metodo (un'analisi simile è stata condotta su piccole proteine particolarmente stabili). In una seconda fase del progetto affronteremo più specificamente lo studio del folding e dell'interazione con i leganti sia per BLG che per LbFABP.

Enti finanziatori:

Ateneo
Finanziamento: assegnato e gestito dal Dipartimento
Programma: RICATENEO - Finanziamenti d'Ateneo per la Ricerca Scientifica

Partecipanti al progetto

Henriette Molinari
Silvia Romagnoli
Raffaella Ugolini

Attività

Strutture