Proteomica differenziale delle demenze sporadiche: individuazione di biomarker liquorali e plasmatici a scopo di diagnosi precoce e/o come marcatori di attività di malattia e controllo biochimico della terapia farmacologia.

Starting date
April 1, 2006
Duration (months)
24
Departments
Biotechnology
Managers or local contacts
Bossi Alessandra Maria

Nell’era post-genomica l’analisi dell’insieme delle proteine espresse da un genoma, ovvero l’analisi del proteoma, sta emergendo come disciplina fondamentale nelle scienze biologiche e biomediche [1-3]. L’analisi proteomica è un approccio globale, che permette di mappare –in linea di principio- tutte le proteine espresse da una cellula, da un tessuto, da un fluido o da un microrganismo, in una certa fase della sua vita o in una certa condizione es. patologica.
E’ immediata l’osservazione della estrema complessità delle proteine espresse, ovvero del proteoma, di una cellula o di un tessuto, ovvero la co-esistenza di alcune migliaia di proteine. Ciò pone difficoltà pratiche alla separazione e risoluzione delle miscele di proteine di un campione biologico.
Ad oggi, il metodo di analisi elettivo per l’indagine proteomica si avvale della separazione elettroforetica in due dimensioni (2D-elettroforesi). I protocolli di elettroforesi bidimensionale (2D) per la mappatura delle proteine, prevedono un primo passaggio di isoelettrofocalizzazione (IEF) delle proteine in gradienti di pH immobilizzati (IPG), cioè una separazione in base alla carica, seguita da una separazione ortogonale su gels in presenza di sodio dodecil solfato (SDS), ovvero una separazione che discrimina le proteine sulla base della loro dimensione. [3-5,23]
Tale accoppiamento di tecniche, risulta in un metodo di indagine estremamente potente, con un potere di risoluzione pari al prodotto delle risoluzioni delle singole metodiche separative. La 2D elettroforesi può risolvere idealmente un migliaio di proteine per singolo gel, permettendo una completa separazione delle proteine espresse dalla cellula o dal tessuto.
Una tecnica di indagine di grande potenzialità per problemi biomedici è la proteomica differenziale essa consiste nella mappatura del pool proteico sia di campioni controllo, che di soggetti patologici, cui segue l’individuazione delle proteine variamente espresse, sovra o sotto-regolate, a seguito della predisposizione genetica dell’organismo ad una patologia, dell’insorgere della patologia o del progredire di essa. L’identificazione di ciascuna proteina differenzialmente espressa avviene per mezzo della spettrometria di massa [6-8] che permette anche di ottenere informazioni parzialmente quantitative [9]. I dati ottenuti dalla mappatura 2D vengono poi confrontati in banche dati proteiche e funzionali, con l’obiettivo di stabilire correlazioni tra le proteine sovra- o sotto-espresse in uno stato patologico, portando così all’identificazione di marker proteici associabili ad una patologia [10].
La proteomica ha dimostrato in questi anni di essere uno strumento molto potente per l’indagine biomedica e si colloca tra le metodiche più efficaci per offrire una panoramica globale dello stato molecolare relativo alla patologia [11, 12]. Infatti i profili di espressione globale ottenuti da un’analisi proteomica possono descrivere come prendono luogo le interazioni molecolari, fornendo in questo modo markers molecolari specifici che caratterizzano differenti gruppi prognostici. I dati ottenuti con questa metodologia possono migliorare la conoscenza della patogenesi, e possono identificare nuove molecole bersaglio per trattamenti farmacologici individualizzati, come pure proteine marker-diagnostici, rivelabili tramite metodiche a basso costo ben conosciute come l’analisi immunoistochimica su sezioni istologiche.
Lo studio di malattie neurodegenerative è stato intrapreso con metodiche di proteomica [12-15, 21]. La proteomica del fluido cerebrospinale (CSF) –chiamato anche liquor- è di grande interesse per identificare biomarker relativi alle patologie neurodegenerative [16]. In tale senso, è indirizzata una review [17], recentemente pubblicata, in cui viene valutato il contributo della proteomica classica (2D elettroforesi) e di proteomica basata su spettrometria di massa di superficie SELDI (surface enhanced laser desporption ionisation), ovvero un tipo di spettrometria di massa specificatamente studiato per l’analisi di campioni biologici complessi, per l’identificazione di biomarker attribuibili a soggetti affetti da Alzheimer (AD), rispetto a soggetti affetti da altre forme di demenza.
Sono state identificate alcune proteine marker, maggiormente variate nella loro espressione a seguito dell’insorgere di demenze, tra queste si collocano le apolipoproteine e le preapolipoproteine [18], che hanno permesso di stabilire una correlazione tra demenza e un metabolismo del colesterolo deficiatario; ma anche un’isoforma dell’alfa-1-antitripsina; l’alfa-2-HS glicoproteina, la trans-tiretina, l’albumina, la beta-2-microglobulina [19]. I risultati ottenuti con le analisi proteomiche del CSF offrono alcune contraddizioni e disomogeneità sul numero di proteine variate e sul tipo di proteine variate. Particolarmente eclatante è il caso della apoliproteina che non risulta variata, in tutti quei lavori in cui il campione viene sottoposto a prefazionamento. Parallelamente il pre-frazionamento migliora di molto la possibilità di evidenziare proteine diversamente espresse (ne vengono evidenziate 37, rispetto a 9 di un campione non pre-frazionato) [17]. I lavori di proteomica del CSF pubblicati non sempre contengono informazioni statisticamente valide, sia per il numero di soggetti analizzato, che per la mancanza di analisi statistica dei dati [20].
Benché la ricerca proteomica sulle demenze è ad oggi a uno stadio preliminare, è evidente dai dati di letteratura a riguardo, che essa offre spunti preziosi per identificare e tipizzare le demenze.
Pertanto, la presente proposta di ricerca, propone un’indagine proteomica per la ricerca delle basi molecolari di tali malattie, indirizzando l’indagine a soggetti affetti da demenze sporadiche. Inoltre, la mappatura proteomica di soggetti sottoposti a trattamento farmacologico, permette una valutazione globale degli effetti biochimico molecolari dei farmaci [22]. In particolare, le informazioni di 2D-elettroforesi sulle variazioni di espressione dei marcatori proteici a seguito del trattamento farmacologico, risultano correlabili con informazioni ottenibili da altre metodiche di indagine, quali le analisi immunomicroscopiche, di western blotting e citofluorimetriche.
Gli obiettivi della ricerca sono:
a) mappatura dei profili proteomici differenziali (di liquor e plasma) di soggetti affetti da demenze, suddivisi per genotipo, e di soggetti controllo sani.
b) individuazione di profili proteomici (di liquor e plasma) caratterizzanti le varie forme di demenza
c) identificazione di biomarker, ovvero di proteine diversamente espresse in soggetti patologici, tramite spettrometria di massa ESI-MS e interrogazione di Banche Dati proteiche e genomiche.
d) mappatura proteomica del plasma di soggetti affetti da demenze, sottoposti a trattamento famacologico, per il controllo delle variazioni biochimiche conseguenti al trattamento.
e) correlazione dei dati proteomici con i dati clinico-farmacologici

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PRIN VALUTATO POSITIVAMENTE
Funds: requested
Syllabus: PRIN

Project participants

Alessandra Maria Bossi
Associate Professor

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