Post genomica di leguminose foraggere

Data inizio
5 novembre 2002
Durata (mesi) 
46
Dipartimenti
Biotecnologie
Responsabili (o referenti locali)
Spena Angelo

Patogenesi e simbiosi sono oggi considerate come variazioni di un tema comune. Infatti, alcune caratteristiche dell'interazione pianta-patogeno sono presenti anche nella simbiosi leguminose - rizobio. Per esempio, la maggior parte delle infezioni operate dai rizobi abortiscono, e solo una piccola percentuale induce lo sviluppo del nodulo colonizzandolo. Gli aspetti comuni a patogenesi e simbiosi riguardano principalmente il processo iniziale di riconoscimento tra l'ospite ed il simbionte/patogeno, che può esitare nell'induzione del processo di infezione, nell'induzione di risposte di resistenza da parte dell'ospite, e nella soppressione di questa risposta di resistenza permettendo interazioni compatibili sia nella patogenesi sia nella simbiosi. Pertanto, la comprensione che alcune delle risposte della pianta ad organismi utili sono, almeno nelle prime fasi dell'interazione, simili a quelle elicitate da stress biotico, rende necessaria, ai fini del miglioramento genetico, l'identificazione e la caratterizzazione dei geni coinvolti nei meccanismi di resistenza agli stress biotici e la loro eventuale associazione ai segnali molecolari che modulano il processo di infezione operato dal microrganismo simbionte.
Compito di questa Unita di Ricerca è l'identificazione e lo studio delle modificazioni a livello trascrizionale elicitate da stress biotici (microrganismi patogeni) in piante di M. truncatula. I dati ottenuti saranno analizzati confrontandoli con le modificazioni trascrizionali elicitate dal processo di nodulazione in piante inoculate con rizobi. Ciò al fine di individuare i trascritti e, quindi, i geni indotti in entrambe le condizioni (patogenesi e simbiosi), e quei trascritti/geni specificamente indotti in uno dei due fenomeni (patogenesi o nodulazione). La conoscenza dell'espressione di questi geni potrà individuare i geni che controllano diverse fasi del processo di noduazione, e potrà essere utilizzata sia per migliorare la capacità di interazione pianta/rizobio sia per contrastare l'interazione pianta/patogeni. Per la caratterizzazione molecolare delle componenti genetiche di M. truncatula coinvolte nel processo simbiontico e nella resistenza agli stress biotici, si prepareranno ed analizzeranno microarray contenenti un numero sufficientemente rappresentativo di geni. Ad oggi oltre 140.000 EST di M. truncatula sono disponibili in banca dati. Le EST saranno utilizzate per disegnare e produrre regioni di DNA gene-specifiche rappresentanti, in modo non ridondante, il genoma di M. truncatula. Per identificare le regioni di DNA specifiche per ogni gene, ciascuna sequenza cDNA sarà analizzata con BLASTn contro le regioni note del genoma di M. truncatula, i segmenti omologhi a più di una regione di DNA, quindi non specifici, saranno scartati. I primer verranno disegnati sulle regioni identificate e porteranno un'estensione al 5' (17 nucleotidi) che ne permetterà la riamplificazione impiegando un numero limitato di primer universali facilitando così il processo di riamplificazione necessario per la preparazione dei microarray. Numerosi passaggi tecnologici dovranno essere ottimizzati per la costruzione e l'ibridazione di microarray ad alta densità di cDNA, quali l'estrazione dell'RNA da M. truncatula, la sintesi di cDNA e la marcatura delle sonde. Per il trasferimento del DNA sui vetrini verrà impiegata il robot SpotArray 24. Circa 2000 geni espressi durante la simbiosi e la patogenesi saranno impiegati per la preparazione di microarray da utilizzare in esperimenti preliminari di ibridazione. Il microarray prodotto conterrà anche controlli negativi, costitutivi e tessuto-specifici. Controlli positivi includeranno geni il cui profilo di espressione è già stato noto. Esempi includono geni codificanti per la leghemoglobina e altre noduline come marcatori dello sviluppo del nodulo: chlorophyll a/b binding protein e rubisco per i tessuti verdi, e diversi geni coinvolti nei meccanismi di difesa espressi nei tessuti invasi dai patogeni.
I microarray prodotti saranno ibridati ad RNA estratto da tessuti vegetali sottoposti ad infezione con microrganismi patogeni e simbionti. L'analisi di espressione, sarà condotta in diversi stadi del processo di patogenesi su cultivar suscettibili e resistenti all'infezione con Colletotrichum trifolii e Phytophthora medicaginis. Saranno anche analizzate radici di M. truncatula durante le diverse fasi di sviluppo dell'interazione simbiotica con il rizobio. I microarray verranno analizzati tramite il lettore confocale ScanArray 4000XL.

Obiettivo di questa attività è l'identificazione dei geni di M. truncatula coinvolti nell'interazione con microrganismi per caratterizzarne la funzione nella risposta di resistenza ai patogeni e/o nella simbiosi. I profili di espressione saranno analizzati in dettaglio impiegando il software Stanford Cluster/Treeview, già disponibile. L'analisi cluster porterà all'identificazione di gruppi di geni con profilo di espressione simile. I geni la cui espressione sia alterata sia durante la risposta di resistenza ai patogeni sia durante il processo simbiontico saranno caratterizzati e impiegati per classificare i geni potenzialmente importanti nei programmi di miglioramento genetico volti all'ottenimento di piante più resistenti agli attacchi patogeni e in grado di stabilire un più efficiente rapporto con il microrganismo simbionte Una caratterizzazione funzionale preliminare di alcuni dei geni ritenuti potenzialmente importanti per i programmi di miglioramento genetico volti all'ottenimento di piante più resistenti agli attacchi patogeni ed in grado di causare un più efficiente rapporto con il microrganismo simbionte sarà effettuata mediante:
  1. clonaggio del gene completo e sua sovraespressione in M. truncatula a seguito di trasformazione genetica con A. tumefaciens;
  2. identificazione di mutanti bloccati nell'espressione del gene mediante approcci di genetica inversa sulla collezione di mutanti sviluppata da altre U.O di questo progetto.
Le analisi da effettuare sulle piante alterate nell'espressione dei geni candidati riguarderanno:
  1. la valutazione della resistenza a microrganismi patogeni analizzando a livello molecolare e biochimico sia la risposta di ipersensibilità sia le risposte di resistenza sistemica a infezioni secondarie;
  2. capacità simbiotica rispetto a quella riscontrata in piante selvatiche.
Risultati attesi:
  • identificazione e produzione di regioni di DNA gene-specifiche rappresentanti il trascrittoma di M. truncatula da impiegare per la preparazione di microarray specifici (12 mesi);
  • ottimizzazione delle fasi di costruzione dei microarray e delle condizioni di ibridazione (18 mesi);
  • produzione di microarray contenenti una serie non ridondante di circa 2000 EST espressi durante la simbiosi e/o la patogenesi (18mesi);
  • identificazione dei geni di M. truncatula la cui espressione è modulata sia durante la risposta di resistenza ai patogeni sia durante il processo simbiontico o solo in uno dei due fenomeni (24 mesi);
  • produzione e/o identificazione di mutanti alterati nell'espressione dei geni selezionati, valutazione della capacità simbiotica e del grado di resistenza a microrganismi patogeni (36 mesi).

Enti finanziatori:

Ministero dell'Istruzione dell'Università e della Ricerca
Finanziamento: assegnato e gestito da un ente esterno all'ateneo
Programma: FIRB

Partecipanti al progetto

Massimo Crimi
Professore associato
Massimo Delledonne
Professore ordinario
Matteo De Stefano
Paola Dominici
Professore ordinario
Fabio Finotti
Tecnico-Amministrativo
Tiziana Pandolfini
Professore associato
Mario Pezzotti
Professore ordinario
Youry Pii
Annalisa Polverari
Professore associato
Angelo Spena

Attività

Strutture