Sviluppo di tecnologie avanzate per lo studio della proteomica differenziale del segnale (Segnalo-Proteomica)

Starting date
November 21, 2003
Duration (months)
48
Departments
Biotechnology, Medicine
Managers or local contacts
Righetti Piergiorgio

Compiti dell'unità di ricerca di Verona:
  1. scopo primario della nostra unità è la messa a punto di un protocollo per la generazione di mappe bidimensionali ad alta risoluzione che permettano lo studio dei processi-segnale nei diversi stadi di sviluppo cellulare e nelle cellule indotte da stimoli Ca2+-dipendenti. La determinazione delle proteine diversamente espresse in tali tipi di cellule verrà effettuata tramite l'utilizzo del software PD-Quest, attraverso il confronto delle mappe standard generate per ogni caso esaminato;
  2. il secondo obiettivo è costituito dall'analisi proteomica quantitativa effettuata tramite l'utilizzo di agenti alchilanti isotopici che permettono di effettuare una "marcatura" differenziale dei diversi stati di fosforilazione proteica. Tale analisi permetterà, con l'uso della spettrometria di massa, non solo di confermare i dati quantitativi generati dal software PD-Quest, ma anche di identificare tali proteine che sono coinvolte nel processo di trasduzione segnale. A questo scopo, verrà utilizzata la metodica ICAT (isotope-coded affinity tag), sviluppata di recente da Gygi and Aebersold;
  3. il terzo obiettivo consiste nella generazione di nuove mappe bidimensionali a partire da campioni trattati con enzimi chinasici in grado di defosforilare le proteine coinvolte nel processo di trasduzione del segnale. La variazione di punto isoelettrico (pI) delle proteine in tali mappe permetterà di avere un'ulteriore conferma dell'identità delle proteine coinvolte nel processo a seconda delle varie condizioni di crescita cellulare;
  4. la riduzione della complessità dei campioni costituisce il quarto obiettivo del progetto. Una volta individuati i punti isoelettrici delle proteine coinvolte nel processo-segnale, sarà possibile procedere ad un frazionamento del campione tramite l'utilizzo dell'elettrolizzatore a multicompartimenti [2]. Con questo strumento sarà possibile intrappolare le proteine sotto analisi in stretti intervalli di pH e procedere quindi ad una mappatura in elettroforesi bidimensionale utilizzando gradienti di pH ristretti che permettono una maggiore risoluzione delle proteine. Questo processo di pre-frazionamento permetterà anche di eliminare le proteine più abbondanti, che di solito riducono la qualità del segnale, e quindi di sovraccaricare le proteine presenti in traccia, permettendone quindi la visualizzazione. In un approccio alternativo, la riduzione della complessità della miscela si otterrà tramite HPLC, esplorando l'uso di colonne a scambio ionico ed a fase inversa. I vari compiti saranno condotti in stretta collaborazione con le UO di Napoli, di Roma, di Padova e di Firenze.

Sponsors:

Ministero dell'Istruzione dell'Università e della Ricerca
Funds: assigned and managed by an external body
Syllabus: FIRB

Project participants

Paolo Antonioli
Francesca Antonucci
Annalisa Castagna
Technical-administrative staff
Daniela Cecconi
Associate Professor
Martha Elena Mendietha
Erna Olivieri
Chiara Piubelli
Piergiorgio Righetti

Activities

Research facilities