Ruolo delle Lipid Transfer Protein come proteine di difesa: attività antimicrobica e ruolo dell scambio lipidico

Starting date
September 1, 2005
Duration (months)
12
Departments
Biotechnology
Managers or local contacts
Crimi Massimo

Le LTP (lipid transfer proteins) sono una famiglia di proteine di piccole dimensioni, solitamente basiche, presenti in molti tessuti vegetali; sono state identificate originariamente per la loro capacità di catalizzare lo scambio di lipidi tra membrane e tra organelli (in vitro). In seguito, il ruolo proposto di scambiatori di lipidi intracellulari è stato messo in discussione poiché sono state trovate anche nell'ambiente extracellulare dove partecipano probabilmente alla deposizione di cutina (formazione della cuticola) negli strati cellulari periferici ed epidermici. Recentemente è stato proposto anche che possano avere un importante ruolo nei meccanismi di difesa da patogeni delle piante.
L'analisi delle sequenze note indica che circa un terzo dei residui è conservato, incluse anche 8 residui di cisteina responsabili della formazione di quattro ponti disolfuro (con l'eccezione di una LTP di cotone che possiede solo 6 cisteine e due soli ponti disolfuro). La struttura tridimensionale di questa famiglia di proteine è stata molto studiata, sia con raggi x che con NMR, ed è anche stata risolta in presenza di diverse molecole lipidiche all’interno della cavità idrofobica responsabile del legame con le stesse.
Il pattern di espressione delle LTP nelle piante, dipende dallo stadio di sviluppo (controllo morfogenetico) ma si è visto essere anche influenzato in modo complesso dalla presenza di patogeni che sono in grado di modificare la quantità di trascritti e di proteina in diversi tessuti.
Il progetto si propone di studiare la funzione di queste proteine, in particolare in riferimento alla loro attività anti-microbica ed alla loro caratteristiche di legame e scambio di molecole lipidiche.
La LTP scelta per questi studi è una putativa LTP di Medicago truncatula denominata MtN5 che risulta essere estremamente interessante. Caratterizzata inizialmente come trascritto da noduli-radici, la sequenza aminoacidica di questa proteina infatti presenta omologia di sequenza sia verso le LTP di tipo 1 che verso quelle di tipo 2 e sembra quindi collocarsi in una posizione intermedia tra i due diversi gruppi di LTP.
Per studiare questa proteina il progetto prevede l’utilizzo della proteina ricombinante. Il gene di questa proteina di Medicago truncatula verra clonato in un opportuno vettore di espressione. Per facilitare la purificazione ed il refolding della proteina ricombinante, verrà aggiunta all’estremità N-terminale una coda di istidine. La proteina così ottenuta sarà utilizzata per gli studi in vitro di attività antimicrobica con diversi patogeni per le piante ed anche con patogeni umani di interesse. Verrà anche studiata l’attività di scambio e di legame di lipidi attraverso lo studio del cambiamento della fluorescenza intrinseca delle tirosine che permette di monitorare il legame con i lipidi.
Inoltre, visto le peculiarità della sequenza aminoacidica, se si riusciranno ad ottenere quantità sufficienti di proteina sarà interessante verificare la possibilità di produrre cristalli per ottenere la struttura tridimensionale di questo membro della famiglia LTP. E’ noto infatti che il folding generale di queste proteine è estremamente conservato nonostante le caratteristiche funzionali e il ruolo biologico siano diversi. Risulta perciò di grande interesse la caratterizzazione dei determinanti per diverse funzioni in questa famiglia di proteine. La proteina sarà quindi clonata anche senza la coda di istidine (che a volte risulta essere di disturbo per ottenere buone immagini della struttura tridimensionale con la tecnica della diffrazione a raggi x; si cercherà quindi di mettere a punto un protocollo di espressione, purificazione e di refolding che permetta di ottenere la proteina pura, correttamente ripiegata per gli studi cristallografici.

Sponsors:

Ateneo
Funds: assigned and managed by the department
Syllabus: RICATENEO - Finanziamenti d'Ateneo per la Ricerca Scientifica

Project participants

Massimo Crimi
Associate Professor

Activities

Research facilities