Metodologie di genetica e microbiologia (2019/2020)



Codice insegnamento
4S003254
Crediti
12
Coordinatore
Antonella Furini
Settore disciplinare
AGR/07 - GENETICA AGRARIA
Lingua di erogazione
Italiano
L'insegnamento è organizzato come segue:
Attività Crediti Periodo Docenti Orario
teoria Metodologie di genetica 4 I semestre Diana Bellin, Antonella Furini, Sara Zenoni

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laboratorio Metodologie di genetica [1° turno] 6 I semestre Diana Bellin, Antonella Furini, Sara Zenoni

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laboratorio Metodologie di genetica [2° turno] 6 I semestre Diana Bellin, Antonella Furini, Sara Zenoni

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teoria Metodologie di microbiologia 1 I semestre Sandra Torriani

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laboratorio Metodologie di microbiologia [1° turno] 1 I semestre Sandra Torriani

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laboratorio Metodologie di microbiologia [2° turno] 1 I semestre Giacomo Zapparoli

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Obiettivi formativi

L’obiettivo del Modulo di Metodologie di Genetica è di fornire agli studenti le conoscenze sulle tecnologie del DNA ricombinante e le metodologie applicate alle analisi genetiche molecolari e genomiche. Con le lezioni frontali si fornirà una panoramica delle metodologie genetiche tradizionali e di quelle più innovative per l’analisi dei geni e della loro funzione. I concetti acquisiti consentiranno l'applicazione delle tecnologie molecolari di base utilizzate per gli studi genetici e la comprensione delle metodologie più innovative. Complessivamente queste conoscenze consentiranno agli studenti di seguire e comprendere le parti sperimentali dei lavori scientifici in ambito genetico.
Il modulo di Metodologie di Microbiologia si propone di fornire agli studenti alcuni strumenti di conoscenza nel settore microbiologico e biotecnologico che consenta loro di affrontare i corsi di livello superiore dell’area biotecnologica; in particolare aiuta a comprendere le potenzialità applicative dei microrganismi in campo agro-alimentare e le interazioni tra microrganismi, alimento, tratto intestinale e salute

Programma

Il programma del modulo di Metodologie di Genetica include i seguenti argomenti:

Teoria
- Descrizione di colture cellulari vegetali ed animali;
- Trasformazione genetica di piante e cellule animali;
- Vettori e marcatori di selezione, tecniche di clonaggio tradizionali e tecnologia GATEWAY e TOPOCLONING e GOLDENBRAID (1 CFU Prof.ssa Furini)

-Librerie genomiche e librerie di cDNA: vettori plasmidici, Batteriofago λ, Cosmidi, BAC e YAC;
-Trasformazione di cellule batteriche e di lievito;
-Utilizzo di geni reporter (GFP, YFP) per la localizzazione cellulare;
-Preparazione e transfezione di protoplasti;
-Studio dell’interazione DNA-proteine nella regolazione dell’espressione genica: Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP), Shift assay, saggio della luciferase
(1 CFU Prof.ssa Zenoni);

- Estrazione del DNA genomico;
- Analisi dei genomi tramite Southern blotting;
- Marcatori molecolari basati su ibridazione e su PCR ed analisi di linkage;
- Approcci per il mappaggio di geni e l'analisi dei genomi;
- Sequenziamento classico Sanger e sequenziamento NGS;
- Tecniche di mutagenesi random e sito specifica, genome editing e CRISPR/Cas9;
- Genetica diretta e genetica inversa per comprendere la funzione dei geni;
- Estrazione di RNA e analisi dell’espressione genica tramite Northern blotting, RT-PCR e Real Time RT-PCR (2 CFU Prof. Bellin)

Laboratorio
1.Clonaggio di un gene.
Disegno dei primers, allestimento reazione di PCR, Purificazione e quantificazione del DNA, TOPOCloning, trasformazione cellule competenti e verifica dell’inserimento del frammento, purificazione del plasmide e reazione di ricombinazione LR nel vettore di destinazione tramite tecnologia GATEWAY, purificazione del DNA batterico e verifica del clonaggio (Prof. ssa Furini);
2. Trasformazione genetica di tabacco.
Tabacco mantenuto in condizioni di sterilità in vitro, preparazione degli espianti e co-coltivazione con agrobatterio. Analisi del vettore utilizzato per la trasformazione. Coltivazione degli espianti putativamente trasformati su terreno selettivo. Analisi delle piante transgeniche con un saggio enzimatico (saggio istochimico di attività β-glucuronidasica), analisi molecolare per PCR su DNA genomico (Prof.ssa Furini).
3. Transfezione di protoplasti per analisi della localizzazione subcellulare.
Digestione enzimatica della parete cellulare per il rilascio dei protoplasti. Conta e valutazione della vitalità dei protoplasti. Transfezione con differenti vettori e visualizzazione al microscopio a fluorescenza della proteina in diversi compartimenti cellulari (reticolo endoplasmatico, membrana cellulare, vacuolo). (Prof.ssa Zenoni)
4. Analisi con marcatori molecolari basati su PCR di tipo SSLP, SSR ed applicazioni
Estrazione del DNA genomico dall’organismo modello Arabidopsis thaliana o da altre specie utilizzando diverse metodologie di estrazione. Confronto dell’efficienza di estrazione e qualità del DNA prodotto mediante analisi spettrofotometrica e caricamento in gel di agarosio. Amplificazione di marcatori molecolari SSLP e SSR su individui noti ed incogniti e corsa su gel di agarosio. Preparazione mediante purificazione per l’analisi di marcatori SSR mediante sequenziatore ad elettroforesi capillare. Scoring ed analisi dei risultati ottenuti: esempi di analisi di parentela, identificazione varietale ed identificazione delle posizioni genomiche mediante analisi dell’associazione genetica utilizzando marcatori molecolari. (Prof. ssa Bellin).
5. Mutagenesi sito-specifica per sostituire un aminoacido putativamente coinvolto nell’attività enzimatica di una proteina
Analisi della sequenza e determinazione del sito di interesse da mutagenizzare, disegno dei primers specifici per la mutagenesi. Amplificazione con i primer disegnati e reazione di fosforilazione, ligazione e digestione con DpnI per l’arricchimento del plasmide mutagenizzato. Trasformazione di cellule competenti. Recupero delle colonie trasformate e miniprep. Screening dei mutanti mediante amplificazione ed analisi di restrizione. Analisi della sequenza del plasmide selezionato per confermare la mutagenesi e discussione su possibili applicazioni (Prof. ssa Bellin).
6. Analisi di espressione del transgene in un organismo transgenico mediante real-time RT-PCR:
Estrazione dell’RNA dall’organismo transgenico e dal wt. Valutazione della qualità e quantità dell’RNA estratto, trattamento con DNAsi, retrotrascrizione e reazione real-time RT-PCR. Valutazione dei diversi livelli di espressione del transgene nel controllo e nell’organismo transgenico mediante calcolo del deltadeltaCt (Prof. ssa Zenoni).
7. Analisi dell’interazione DNA-proteina e valutazione del legame di un fattore di trascrizione al promotore di un gene target tramite immunoprecipitazione della cromatina.
Fissazione di due tessuti vegetali caratterizzati da una diversa espressione di un fattore di trascrizione. Estrazione della cromatina dai due tessuti, sonicazione e valutazione tramite corsa elettroforetica della frammentazione del DNA, immunoprecipitazione con l’anticorpo specifico contro il fattore di trascrizione, rilascio del DNA immunoprecipitato e analisi PCR per valutare la presenza del gene target nei due tessuti analizzati (Prof. ssa Zenoni).

Il programma del modulo di Metodologie di Microbiologia include i seguenti argomenti:

Teoria
- Il rischio nel laboratorio di microbiologia. Classificazione e pericolosità degli agenti biologici. Microrganismi geneticamente modificati (MOGM). Classi di impiego dei MOGM. Norme di biosicurezza.
- Il microbiota del tratto gastro-intestinale dell’uomo. Fattori che influenzano la composizione del microbiota (età, antibiotici, dieta, malattie). Probiotici e prebiotici.
- L’antibiotico-resistenza (AR) nei batteri alimentari: possibili rischi per i consumatori. Il concetto QPS. Meccanismi di AR. Trasferimento di geni di AR. Nuovi approcci per lo studio dell’AR (Prof.ssa Torriani)

Laboratorio
E’ previsto 1 CFU di esercitazioni durante il quale saranno applicati approcci tradizionali e biomolecolari per :
- lo studio di colture batteriche impiegate nella produzione di alimenti funzionali (es latti fermentati probiotici),
- la ricerca e caratterizzazione di batteri commensali con antibiotico-resistenze in prodotti con microbiota complesso (Prof.ssa Torriani, Prof. Zapparoli)

Modalità d'esame

Sia per il modulo di Metodologie di Genetica che per il modulo di Metodologie di Microbiolgia, alla fine del corso gli studenti devono consegnare le relazioni inerenti le esperienze di laboratorio. L’accertamento dell’apprendimento si effettua mediate prova scritta relativa a quanto illustrato durante il corso nelle lezioni frontali e di laboratorio svolte. Si compone di quesiti aperti, test a crocette ed esercizi relativi alla parte di laboratorio.