Tecniche molecolari applicate ai vegetali (2017/2018)



Codice insegnamento
4S003257
Crediti
6
Coordinatore
Barbara Molesini
Settore disciplinare
BIO/04 - FISIOLOGIA VEGETALE
Lingua di erogazione
Italiano
L'insegnamento è organizzato come segue:
Attività Crediti Periodo Docenti Orario
teoria 4 II sem. Barbara Molesini

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laboratorio 2 II sem. Barbara Molesini

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Obiettivi formativi

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MM: teoria
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Al termine del corso, lo studente acquisirà le conoscenze teoriche e pratiche per la realizzazione di svariate tipologie di costrutti genici volti all'ottenimento di piante transgeniche, cisgeniche ed intrageniche. Inoltre, verranno trattate in maniera approfondita le tecniche per il genome editing. Particolare attenzione verrà posta all'applicazione delle tecniche trattate per il miglioramento qualitativo e quantitativo della produzione di piante di interesse agrario.
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MM: laboratorio
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L'attività di laboratorio fornirà allo studente le conoscenze necessarie per il disegno sperimentale sotteso alla risoluzione di due quesiti biologici di partenza e per la valutazione critica dei dati sperimentali.

Programma

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MM: teoria
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Meccanismo molecolare della trasformazione stabile mediante Agrobacterium: inserimento del T-DNA nel contesto cromatinico, modelli molecolari proposti per l'integrazione; integrazione del transgene, stabilità, metilazione e silenziamento: strategie per evitare il silenziamento del transgene (es: ricombinazione sito-specifica per una precisa integrazione del transgene e riduzione della complessità delle inserzioni); promotori impiegati per la realizzazione di costrutti genici (es: costitutivi, spaziotemporali, inducibili e sintetici); analisi di putative sequenze promotrici per l'identificazione di elementi di regolazione in cis; geni reporter (fusione trascrizionale e traduzionale); tecniche impiegate per lo studio dell'interazione DNA-proteina: Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP), DNA electrophoretic mobility shift assay, DNA pull-down assay; accoppiamento di promotori sintetici e fattori di trascrizione sintetici per la regolazione coordinata di geni multipli; ingegnerizzazione di transgeni multipli; cisgenesi ed intragenesi e relativi costrutti genici; microRNA artificiali e target mimicry e relativi costrutti genici; strategie volte a rimuovere i geni marcatori da piante trasformate geneticamente (es: attraverso ricombinasi sito-specifiche sotto il controllo di promotori inducibili); DNA nucleasi artificiali (ZFNs e TALENs) e DNA nucleasi guidate da RNA (sistema tipo II CRISPR-Cas9 di Streptococcus pyogenes) per l’ingegnerizzazione del genoma; meccanismo molecolare del sistema CRISPR-Cas9 di tipo II; considerazioni pratiche sul disegno di sgRNA; minimizzare l’effetto off-target (es: impiego di Cas9 modificate e modificazioni nella lunghezza dei sgRNA); altre applicazioni del sistema CRISPR: CRISPR interference, regolazione espressione genica, cargo delivery; costrutti genici per l’ingegnerizzazione del genoma attraverso il sistema CRISPR-Cas9; analisi di mutanti mediante analisi RFLP, T7 endonuclease I, heteroduplex mobility assay; teoria dell’ibridazione tra acidi nucleici e metodi per la marcatura di sonde a RNA/DNA. Materiale didattico a supporto del corso: Lezioni in formato power point, articoli scientifici inerenti agli argomenti trattati
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MM: laboratorio
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- Trascrizione in vitro per produzione di molecole dsRNA, applicazione in planta (Solanum lycopersicum) di dsRNA dopo emasculazione di fiori allo scopo di indurre RNA silencing di un noto repressore dell'allegagione. - Disegno di sgRNAs mediante software bioinformatici; preparazione del templato mediante PCR overlapping, trascrizione in vitro di RNA guida e validazione dei migliori candidati per il taglio - mediato da Cas9 - di frammenti di PCR corrispondenti a diverse porzioni del gene bersaglio.

Modalità d'esame

L’esame avrà lo scopo di accertare le conoscenze dello studente riguardo agli argomenti trattati durante le lezioni ed i laboratori. L'esame consisterà in una prova scritta individuale, contenente domande a risposta aperta ed esercizi; la modalità di esame sarà la stessa per studenti frequentanti e non frequentanti.

Opinione studenti frequentanti - 2017/2018