Biochemistry and analytical biochemistry - BIOCHIMICA E BIOCHIMICA ANALITICA: BIOCHIMICA ANALITICA (2015/2016)

Course code
4S02696
Credits
4
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    Academic sector
    BIO/10 - BIOCHEMISTRY
    Language of instruction
    Italian
    Teaching is organised as follows:
    Activity Credits Period Academic staff Timetable
    teoria 2 I semestre Alessandra Astegno
    laboratorio [1° turno] 2 I semestre Alessandra Astegno
    laboratorio [2° turno] 2 I semestre Alessandra Astegno

    Lesson timetable

    I semestre
    Activity Day Time Type Place Note
    teoria Tuesday 10:30 AM - 12:30 PM lesson Lecture Hall F from Oct 20, 2015  to Jan 29, 2016
    laboratorio [1° turno] Wednesday 1:30 PM - 6:30 PM laboratorio Laboratory Laboratorio di Biochimica  
    laboratorio [2° turno] Thursday 2:30 PM - 7:30 PM laboratorio Laboratory Laboratorio di Biochimica  

    Learning outcomes

    Conoscenza e sperimentazione delle metodologie biochimiche di base, attraverso lezioni teoriche e pratiche. Lo studente riceverà una preparazione sistematica sulle principali tecniche impiegate nel laboratorio di biochimica per l’identificazione, l’isolamento e lo studio strutturale e funzionale delle macromolecole biologiche, con particolare attenzione alla purificazione ed identificazione di proteine.

    Syllabus

    Purificazione delle proteine
    Proprietà ioniche di amminoacidi e proteine. Punto isoelettrico. Preparazione del campione. Metodi di rottura delle cellule e produzione degli estratti grezzi iniziali. Metodi di solubilizzazione delle proteine. Tamponi salini. Tecniche di frazionamento e precipitazione. Filtrazione, dialisi, concentrazione del campione.

    Tecniche spettroscopiche.
    Proprietà della radiazione elettromagnetica. Interazione luce-materia. Stati e processi coinvolti nei fenomeni di assorbimento, emissione e decadimento. Spettroscopia di assorbimento nell’ultravioletto e nel visibile. Aspetti qualitativi e quantitativi dell'assorbimento della luce. Metodi colorimetrici e spettroscopici applicati alla determinazione della concentrazione proteica. Spettrofotometri. Spettroscopia di emissione e fluorescenza. Fluorofori intrinseci ed estrinseci. Proteine fluorescenti (Green fluorescent protein) Spettrofluorimetri. Fluorescence resonance energy transfer (FRET). Dicroismo circolare.

    Metodi di centrifugazione.
    Principi fondamentali della sedimentazione. Tipi di centrifuga. Tipi di rotore. Centrifugazione preparativa: differenziale, in gradiente di densità. Applicazioni pratiche della centrifugazione preparativa e frazionamento subcellulare. Centrifugazione analitica e sue applicazioni.

    Tecniche cromatografiche.
    Principi della cromatografia. Il cromatogramma. Parametri che determinano le prestazioni cromatografiche. Equazione di Van Deemter. Cromatografia su colonna: scambio ionico, esclusione molecolare, affinità, interazione idrofobica e loro applicazioni.

    Tecniche elettroforetiche.
    Principi generali e mobilità elettroforetica. Materiali di supporto. Elettroforesi di acidi nucleici. Elettroforesi di proteine. SDS PAGE. Elettroforesi in condizioni native. Colorazione delle proteine su gel. Blotting delle proteine (western blotting). Isoelettrofocalizzazione. Elettroforesi capillare. Gel elettroforesi bidimensionale.

    Laboratorio
    1. Determinazione della concentrazione di una proteina incognita tramite assorbimento a 280 nm e tramite metodo colorimetrico Bradford.
    2. Determinazione dello spettro d’assorbimento del coenzima piridinico NADH (forma ridotta) e determinazione del coefficiente di estinzione molare del NADPH.
    3. Determinazione dei parametri cinetici, costante di Michaelis-Menten e numero di turnover, dell’enzima fosfatasi acida utilizzando il metodo di linearizzazione grafica di Lineweaver-Burk.
    4. Determinazione del peso molecolare di una proteina incognita mediante cromatografia ad esclusione molecolare.
    5. Separazione di proteine mediante elettroforesi in condizioni denaturanti (SDS-PAGE) seguita dalla visualizzazione delle bande mediante colorazione con Blu di Comassie
    6. Trasferimento delle proteine su membrana di nitrocellulosa mediante elettroblotting seguita da immunorivelazione delle proteine per l’identificazione di una o più proteina sfruttando la specificità di legame con un anticorpo (WESTERN BLOT).

    Assessment methods and criteria

    L’esame finale (scritto) verterà su tutti gli argomenti del programma. Lo studente dovrà dimostrare di aver compreso e di essere in grado di utilizzare i concetti fondamentali di ogni argomento.

    Reference books
    Activity Author Title Publisher Year ISBN Note
    teoria Monica Stoppini, Vittorio Bellotti Biochimica applicata EDISES 2012
    laboratorio M. C. Bonaccorsi di Patti, R. Contestabile, M. L. Di Salvo Metodologie Biochimiche Casa Editrice Ambrosiana 2012
    laboratorio Keith Wilson, John Walker-Edizione italiana a cura di M.S. Pilone e L. Pollegioni Biochimica e biologia molecolare - Principi e tecniche - Le bioconoscenze e le biotecnologie in laboratorio Raffaello Cortina Editore 2006

    STUDENT MODULE EVALUATION - 2015/2016