Metodi analitici molecolari (2010/2011)

Codice insegnamento
4S02774
Crediti
9
Coordinatore
Daniela Cecconi
Altri corsi di studio in cui è offerto
L'insegnamento è organizzato come segue:
Modulo Crediti Settore disciplinare Periodo Docenti
PROTEOMICA 3 CHIM/01-CHIMICA ANALITICA Vedi pagina del modulo Vedi pagina del modulo
GENOMICA E TRASCRITTOMICA 3 CHIM/01-CHIMICA ANALITICA Vedi pagina del modulo Vedi pagina del modulo
METABOLOMICA 3 CHIM/01-CHIMICA ANALITICA Vedi pagina del modulo Vedi pagina del modulo

Obiettivi formativi

Modulo: GENOMICA E TRASCRITTOMICA
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Il corso vuole presentare alcune delle metodologie analitiche avanzate oggi utilizzate per l’analisi del genoma, la caratterizzazione della funzione dei geni e l’analisi del trascrittoma. Il corso ha lo scopo di fornire sia una conoscenza teorica di tali tecnologie che una competenza pratica.


Modulo: PROTEOMICA
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Tale corso è a livello avanzato ed ha lo scopo di fornire agli studenti le cognizioni più recenti ed aggiornate nel campo della scienza dell'analisi del proteoma, che oggi rappresenta una delle tecniche più avanzate tra tutte le scienze biologiche/biomediche.


Modulo: METABOLOMICA
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Il corso intende presentare una descrizione attuale del metaboloma, dei più avanzati metodi analitici di indagine e degli strumenti statistici per l’analisi multivariata dei dati. Gli approcci descritti permettono di affrontare lo studio di dinamiche biologiche e prodotti alimentari.

Programma

Modulo: GENOMICA E TRASCRITTOMICA
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TEORIA:
GENOMICA:
-TECNOLOGIA GATEWAY: il sistema di ricombinazione del fago lambda ed introduzione alla tecnologia gateway, reazioni BP ed LR, sistema di selezione basato su gene ccdB, come ottenere un ENTRY clone, TOPO cloning, vettori di destinazione gateway compatibili.
-MUTAGENESI: mutazioni, utilizzo della mutagenesi in genetica diretta ed inversa, mutagenesi random (chimica e basata su PCR), mutagenesi sito diretta (basata su PCR o no), Quickchange, DNA shuffling.
TRASCRITTOMICA:
-RT-PCR E REAL TIME RT-PCR: metodiche per l’analisi dell’espressione genica di singoli geni e su vasta scala, RT-PCR, Real Time RT-PCR, quantificazione assoluta e relativa (esempio di analisi dei dati: metodo delta delta Ct), SYBR green per real time RT-PCR, sonde TaqMan, LUX, Molecolar Beacons e Scorpions
-MICROARRAY: cDNA microarray e loro produzione, oligoarray e loro produzione, marcatura diretta ed indiretta dei campioni, disegno sperimentale e controlli per analisi microarray, ibridazione, acquisizione dell’immagine e cenni generali su analisi dei dati

LABORATORIO:
Clonaggio di un gene mediante la tecnologia Gateway e trasferimento del gene in un vettore di destinazione
Analisi di espressione mediante Real Time RT-PCR
Analisi trascrittomica mediante microarray


Modulo: PROTEOMICA
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1. Introduzione. Le scienze “omiche”. Analisi proteomica di espressione, funzionale e strutturale.
2. Metodiche cromatografiche bi- o multi-dimensionali per l’analisi del proteoma. Multidimensional protein idenfication technology (MudPIT) e MultiDimensional Liquid Chromatography (MDLC).
3. Metodiche elettroforetiche per l’analisi del proteoma. Isoelettrofocalizzazione (anfoliti trasportatori, IEF; e gradienti di pH immobilizzati IPG). Elettroforesi su gel di poliacrilammide (PAGE). (SDS, Nativa, e PAGE a Gradiente). Mappe bidimensionali.
4. La preparazione del campione nell’analisi proteomica. Rottura delle cellule, rimozione delle sostanze interferenti, solubilizzazione delle proteine, e quantificazione proteica.
5. Il pre-frazionamento per l’analisi proteomica di proteine poco abbondanti. Intervallo dinamico. Centrifugazione differenziale; immunoprecipitazione; estrazione multi-step delle proteine; rimozione per affinità (rimozione di albumina, e sferette equalizzatrici Protein Equalizer Technology); frazionamento isoelettrico (Rotofor, ed Elettrolizzatore a multi compartimenti)
6. Acquisizione e analisi di immagini di mappe 2D: PDQuest ed altri softwares. Analisi proteomica comparativa
7. La spettrometria di massa nell’analisi delle proteoma. Interpretazione degli spettri di massa. Metodi di ionizzazione hard (impatto elettronico EI) e soft (ionizzazione chimica CI, fast atom bombardment FAB, matrix assisted laser desorption ionization MALDI, e electrospray ionization ESI). Analizzatori (settore magnetico, quadrupolo Q, tempo di volo TOF, trappola ionica IT, ciclotrone ionico in trasformata di Fourier FT ICR). Rivelatori.
8. La spettrometria di massa/massa nell’analisi del proteoma. Frammentazione di un peptide. Frammentazione nello spazio (TripleQ, Q-TOF, e TOF/TOF). Frammentazione nel tempo (MALDI-TOF post source decay PSD, e IT).
9. Analisi degli spettri di massa. Programmi per la ricerca in Banche Dati e Banche Dati per l’identificazione delle proteine. Il fingerprinting proteico (PMF) e sequenziamento di peptidi con analisi tandem.
10. La proteomica quantitativa. Elettroforesi bidimensionale fluorescente differenziale (DIGE), marcatura minima o a saturazione; marcatura isotopica stabile attraverso incorporazione biologica di amminoacidi in coltura cellulare (SILAC); marcatura isotopica di affinità (ICAT); marcatura isobarica per la quantificazione relativa e assoluta (iTRAQ); quantificazione assoluta (AQUA); acrilammide d0/d3; marcatura enzimatica (H218O/ H216O); e quantificazione senza marcatura (surface enhanced laser desorption/ionization SELDI-MS).
11. Caratterizzazione delle modificazioni post-traduzionali delle proteine. Glicosilazione, nitrazione e nitrosilazione, e fosforilazione. (IMAC; immunoprecipitazione; biotin-switch e altri approcci).
12. Applicazioni dell’analisi proteomica.


Modulo: METABOLOMICA
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TEORIA:

INTRODUZIONE Metaboliti, metabolomica, scienze ‘omiche’, obiettivi, approcci sperimentali, cenni metodi cromatografici, spettrometria di massa, preparazione campioni

BASI TEORICHE SPETTROSCOPIA NMR spin, nuclei attivi, interazione spin/campo magnetico, transizioni, precessione, magnetizzazione, impulso, trasformata di Fourier, rilassamento

CHEMICAL SHIFT E ACCOPPIAMENTO SCALARE scala di riferimento, effetti di schermo, campi magnetici indotti, contributi diamagnetici, contributi anisotropici, sistemi di spin, accoppiamenti scalari forti

SPETTROSCOPIA NMR MULTIDIMENSIONALE E OPERAZIONI SPERIMENTALI DI ESECUZIONE basi di spettroscopia bidimensionale, correlazioni eteronucleari, scalari, spettri J-resolved, effetti della temperatura e del pH, soppressione del solvente

ANALISI STATISTICA MULTIVARIATA metodi supervised e unsupervised, PCA, PLS, SIMCA


LABORATORIO:

ANALISI SPETTRI Esercizi di analisi di spettri 1D protonici

ESPERIMENTI Preparazione campioni (p.es. succhi frutta), shimming, calibrazione impulsi, soppressione solvente, receiver gain, numero scansioni, parametri acquisizione, parametri processing

ANALISI STATISTICA MULTIVARIATA Uso di software per la visualizzazione di spettri e analisi PCA

Modalità d'esame

Modulo: GENOMICA E TRASCRITTOMICA
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Modulo: PROTEOMICA
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Scritto


Modulo: METABOLOMICA
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